黃芪甲苷對腦缺血小鼠外周免疫抑制作用的影響

鄒瑩香，李世春，王志菲

1.上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203； 2.上海中醫藥大學中西醫結合研究院，上海 201203

腦卒中又稱中風、腦血管意外，是由腦血管破裂或血管阻塞導致腦供血不足而引起腦組織損傷的急性腦血管疾病，可分為缺血性和出血性卒中。在我國，缺血性卒中發病率遠高于出血性卒中，是國民致死和致殘的主要原因之一[1]。據調查統計，85%腦卒中患者有并發癥，其中23%～65%并發感染[2]，且多為外周免疫抑制所致[3]。腦卒中患者免疫抑制主要表現在脾臟明顯萎縮，外周血中淋巴細胞數量減少、活化受損[4]。因此，逆轉腦卒中后外周免疫抑制、減少并發感染可作為改善腦卒中患者預后的治療手段。課題組前期通過大腦中動脈栓塞（MCAO）大鼠模型證實，補陽還五湯可抑制腦缺血后自然殺傷（NK）細胞向缺血腦區浸潤、活化，改善腦缺血損傷；同時發現，補陽還五湯可增加脾臟和外周血中NK細胞比例，提示補陽還五湯可能具有改善腦缺血后外周免疫抑制的作用[5]。補陽還五湯以黃芪為君藥，其主要有效成分黃芪甲苷具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[6]。因此，本實驗以MCAO小鼠為模型，觀察黃芪甲苷對腦缺血后外周免疫抑制的影響，為腦卒中治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠56只，體質量22～23 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（浙）2020-0002，動物使用許可證號SYXK（滬）2020-0009。飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，本實驗經上海中醫藥大學動物倫理委員會批準（PZSHUTCM18121409）。

1.2 藥物及制備

黃芪甲苷對照品，上海同田生物技術有限公司，CAS：84687-43-4，純度≥98%。稱取適量黃芪甲苷對照品，用聚乙二醇、丙二醇、無水乙醇、PBS配制成濃度為4 mg/mL的黃芪甲苷溶液。

1.3 主要試劑與儀器

異氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司，貨號R510-22-4；TTC，德國Sigma公司，貨號T8877；HBSS，生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號A003210；紅細胞裂解液，上海碧云天，貨號C3702；FITC標記抗小鼠NK1.1，美國BD Biosciences，貨號553164；APC標記抗小鼠CD3，美國BioLegend，貨號100236；PE標記抗小鼠NKG2D，美國BioLegend，貨號115606；RPMI 1640培養基，美國Gibco，貨號23400-021；BSA，德國BioFroxx，CAS：9048-46-8。動物呼吸麻醉機（美國哈佛儀器），多普勒血流儀（澳大利亞ADInstruments，Powerlab ML191），動物手術體溫控制儀（美國哈佛儀器，K023986），FACS Calibur流式細胞儀（美國BD Biosciences），離心機（德國Eppendorf，5810R）。

1.4 分組、造模和給藥

將51只小鼠隨機分為假手術組（13只）、模型組（20只）、給藥組（18只）。參照文獻[7]方法制備MCAO模型，使用呼吸麻醉機麻醉小鼠，體溫控制儀監測小鼠肛溫，溫度控制在（37±0.5）℃，先后結扎小鼠頸總動脈和頸外動脈，從頸總動脈進線栓至頸內動脈阻斷中動脈血流，假手術組僅結扎頸總動脈和頸外動脈。多普勒血流儀監控MCAO前后的血流值，將MCAO后血流值與MCAO前血流值比值保持在27%±0.5%。MCAO 45 min后，拔出線栓實現再灌注，給藥組再灌注后按0.1 mL/10 g腹腔注射黃芪甲苷溶液，給藥劑量40 mg/kg，12 h后再次腹腔注射給藥1次，模型組和假手術組注射等量空白溶劑作為對照。

1.5 腦梗死體積測量

再灌注24 h后處死小鼠，將腦組織切成6個厚度1 mm腦片，放入2%TTC溶液，37 ℃水浴鍋避光染色，染色完成后拍照，使用Image J軟件測量每個腦片白色梗死區域面積，計算腦梗死體積（腦片梗死面積總和×腦片厚度）。

1.6 神經功能缺損評分

再灌注24 h后，采用改良的12點神經評分系統[8]對小鼠神經功能缺損情況進行評分，正常記0分，異常記1分，損傷越嚴重，總分越高。

1.7 脾臟和外周血自然殺傷細胞檢測

1.7.1 脾臟及外周血淋巴細胞分離

再灌注24 h后測量小鼠體質量，眼球取血500 μL，處死后分離小鼠脾臟，稱重，放入培養皿中，加入2 mL RPMI 1640培養基研磨，勻漿轉移至15 mL離心管中，加入2 mL紅細胞裂解液置于冰上裂解，輕輕搖晃，使其裂解充分，5 min后加等體積RPMI 1640培養基終止反應；4 ℃、350×g離心5 min，棄上清液，加入6 mL RPMI 1640培養基洗滌，離心；沉淀用1 mL HBSS重懸，進行計數細胞。外周血中加入4 mL紅細胞裂解液，冰上裂解5 min（裂解步驟與脾臟相同）；4 ℃、300×g離心5 min，棄上清液，加入5 mL RPMI 1640培養基洗滌；4 ℃、250×g離心5 min；沉淀用1 mL HBSS重懸，進行細胞計數。

1.7.2 自然殺傷細胞標記及檢測

取一定體積脾臟和外周血細胞懸液（含2×105個細胞），離心，100 μL 1%PBS稀釋抗體（每106個細胞加0.5 μL NK1.1、2.5 μL CD3、1.25 μL NKG2D），重懸細胞后，冰上靜置30 min，每管加入1 mL HBSS，4 ℃、4000 r/min離心6 min；棄去上清，沉淀加入300 μL HBSS重懸，使用流式管收集細胞，檢測NK細胞占淋巴細胞的比例，并檢測NK細胞活力。

1.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析。實驗數據以—x±SE表示，多組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對模型小鼠腦梗死體積的影響

正常腦組織呈鮮紅色，腦缺血損傷后腦組織呈白色。與假手術組比較，模型組小鼠腦組織明顯變白，腦梗死體積明顯增加（P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠腦組織變紅，腦梗死體積明顯減少（P＜0.001）。結果見圖1、表1。

圖1 各組小鼠腦組織形態（TTC染色）

表1 各組小鼠腦梗死體積比較（—x±SE，mm3）

2.2 黃芪甲苷對模型小鼠神經功能缺損評分的影響

與假手術組比較，模型組小鼠神經功能缺損評分明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠神經功能缺損評分明顯降低（P＜0.001）。結果見表2。

表2 各組小鼠神經功能缺損評分比較（—x±SE，分）

2.3 黃芪甲苷對模型小鼠體質量和脾臟質量的影響

與假手術組比較，模型組小鼠體質量和脾臟質量減輕（P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠體質量和脾臟質量有所恢復（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組小鼠體質量和脾臟質量比較（—x±SE，g）

2.4 黃芪甲苷對模型小鼠脾臟和外周血自然殺傷細胞數量的影響

與假手術組比較，模型組小鼠脾臟和外周血NK細胞比例明顯減少（P＜0.05，P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠脾臟和外周血NK細胞比例明顯增加（P＜0.05）。結果見表4、圖2。

表4 各組小鼠脾臟和外周血NK細胞數量比較（—x±SE，%）

圖2 各組小鼠脾臟和外周血NK細胞流式示意圖

2.5 黃芪甲苷對模型小鼠脾臟和外周血自然殺傷細胞活力的影響

與假手術組比較，模型組小鼠脾臟和外周血NKG2D表達明顯降低（P＜0.001）；與模型組比較，給藥組小鼠脾臟和外周血NKG2D表達明顯升高（P＜0.001）。結果見表5、圖3。

表5 各組小鼠脾臟和外周血NKG2D相對表達量比較（—x±SE，%）

圖3 各組小鼠脾臟和外周血NKG2D流式細胞術示意圖

3 討論

腦缺血屬中醫學“中風”范疇，以突然昏仆、不省人事、言語不利、半身不遂為主癥。黃芪具有補氣升陽固表、生津養血消腫等功效[9]。黃芪甲苷是黃芪的代表性成分，研究表明其具有抗炎、抗凋亡[10-11]、促進神經生發[12-13]及血管新生[14]等作用，還具有免疫調節作用，防止中性粒細胞在腦缺血損傷大鼠腦內聚集[15]。

腦缺血后免疫反應分為2個階段：第1個階段是急性期，大量外周免疫細胞在不同時間浸潤腦實質，這些免疫細胞既破壞神經結構，也促進組織修復[16]；第2個階段即腦缺血由急性期向亞急性期發展階段，也是本實驗研究的外周免疫抑制階段，這個階段免疫系統由激活狀態轉變為抑制狀態[4]，免疫抑制主要表現為淋巴器官萎縮、淋巴細胞減少及活化受損。研究顯示，MCAO 22 h后，小鼠脾臟和胸腺組織明顯縮小，脾臟紅髓中的造血成分顯著減少[17]。本研究發現，腦缺血損傷24 h后，小鼠脾臟明顯萎縮，提示腦缺血導致外周免疫抑制的發生，黃芪甲苷給藥后脾臟質量增加，表明黃芪甲苷可改善腦缺血后的免疫抑制。

另有動物實驗表明，MCAO模型小鼠外周免疫器官及外周血中NK細胞、T細胞、B細胞等淋巴細胞數量減少[18]。NK細胞同時具有固有免疫和適應性免疫的特征[19]。一方面，在腦缺血損傷中，NK細胞是最早浸潤入腦的免疫細胞之一，浸潤的NK細胞可加劇神經元死亡，增加局部炎癥及血腦屏障通透性，進一步加重腦梗死[20-21]；另一方面，卒中誘發的免疫抑制容易使患者并發感染，增加死亡風險，NK細胞通過清除感染細胞及產生干擾素-γ在宿主早期防御病原體中發揮關鍵作用[22]。本實驗結果顯示，腦缺血損傷后24 h，小鼠脾臟和外周血NK細胞比例下降，黃芪甲苷干預后，脾臟和外周血NK細胞比例升高，提示黃芪甲苷可改善腦缺血誘導的外周免疫抑制。NKG2D是NK細胞表面的激活性受體，在NK細胞活化中起重要作用。本研究結果顯示，腦缺血損傷后24 h，小鼠脾臟及外周血NKG2D表達降低，黃芪甲苷可上調模型小鼠脾臟及外周血NKG2D的表達，提示黃芪甲苷可增加腦缺血后外周血中NK細胞活力。

綜上，黃芪甲苷可增加腦缺血后脾臟和外周血NK細胞的數量和活力，改善脾臟萎縮，提示黃芪甲苷可能通過改善外周免疫抑制發揮保護腦缺血損傷的作用。本研究有助于了解中藥單體成分在腦缺血損傷中的免疫調節作用及其可能的作用靶點，為腦卒中的臨床治療提供依據。