中藥有效部位提取技術與篩選方法應用研究進展

張志軒，崔樹婷，朱中博，彭超，吳紅彥

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.深圳市羅湖區中醫院，廣東 深圳 518001

中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，分離純化中藥有效部位或有效成分，除去其他無效、低效或有毒成分，降低服用劑量，告別中藥制劑的粗糙過程已是大勢所趨[1]。中藥有效部位是其發揮療效的物質基礎，也是其安全有效和質量控制的關鍵，對揭示中藥多組分、多靶點、多途徑的特點及中藥復方配伍內在規律具有重要意義，中藥有效部位的提取與篩選對中藥新藥研發及指導臨床應用有重要影響[2]。本文對中藥有效部位研究現狀，中藥提取、純化、分離技術及有效部位追蹤篩選方法做一綜述。

1 提取技術

中藥化學成分十分復雜，單味中藥往往含生物堿、氨基酸、有機酸、萜類、甾體、糖類等多種化合物，復方中多味藥物配伍發揮功效不是簡單的化學成分疊加，而且一味藥對不同疾病發揮功效的成分不同。因此，有效部位提取方法研究尤為重要，尋找有效且適宜的提取方法是辨識中藥活性部位的關鍵，也是明確中藥藥效活性成分的關鍵。

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是傳統的中藥提取方法。在中藥提取分離過程中，由于溶劑的滲透作用，溶劑不斷地進入藥材組織細胞，直至細胞內外溶液濃度達到動態平衡，使中藥有效成分溶出。常用方法為水提取法、有機溶劑提取法、煎煮法、連續提取法。宋莉等[3]采用蒸餾水、70%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等不同極性溶劑對夏枯草活性成分進行分析，發現夏枯草不同溶劑提取物均有抗氧化活性，其中有效部位主要集中在70%乙醇提取物，其總酚和黃酮含量最高，且夏枯草70%乙醇提取具有較高的DPPH·、·OH清除活性和脂質體過氧化抑制活性，夏枯草蒸餾水提取物清除活性最佳。溶劑提取法受提取溶劑性質及提取次數、溫度、壓力、時間等影響，且有提取周期長、消耗溶劑大、純度低等缺點。

1.2 超聲提取法

超聲提取技術是近年來提取中藥有效成分的新工藝之一，是利用超聲波輻射藥物溶液產生的機械效應、熱效應、空化效應等，瞬時破壞藥材細胞壁，增強溶劑滲透作用，進而增加中藥活性成分在溶劑中的溶出，具有提取率高、節省藥材與溶劑、提取時間短等優勢，適用于絕大多數有效成分的提取[4]。殷明陽等[5]研究發現，超聲提取法能提高提取率、縮短提取時間，適用于含多糖類成分較多的中藥復方。超聲提取法雖具有提取率高的特點，但與中藥有效成分狀態、極性、溶解性等密切相關，也受超聲頻率、功率、時間等參數影響，適宜的超聲參數與在線測量技術問題有待研究。

1.3 超臨界萃取法

超臨界萃取法是利用流體在超臨界狀態黏度接近氣體、密度接近液體、擴散系數介于氣-液之間的特點，以流體作為溶劑，通過改變溫度或壓力調節溶質的密度，改變溶質的溶解能力，將有效部位提取出來，對中藥不同成分的提取分離具有高選擇性。目前常用的流體多為CO2，具有較低的臨界度與臨界壓力、較高的溫度和壓力靈敏性，常用于中藥有效成分提取[6]。王小生等[7]通過CO2超臨界萃取法對艾葉進行揮發油提取工藝篩選，發現艾葉有效部位提取條件為萃取壓力20 MPa、溫度30 ℃及分離壓力8 MPa、溫度55 ℃，該條件下艾葉揮發油平均提取率為1.443%、桉油精提取量為0.318 mg/g。雖然超臨界流體萃取具有很多優勢，但對中藥提取同樣存在局限性，超臨界萃取裝置價格昂貴，耗能較多，單獨使用常不能滿足有效成分純度的要求，且受中藥極性、分子量影響較大[8]。

1.4 微波提取法

微波提取是利用微波熱效應對藥材及有機溶劑進行加熱，根據不同物質結構不同、吸收微波能力的差異，進行中藥有效成分的溶出，達到提取目的。其提取效率高，操作簡單便捷，廣泛用于中藥提取研究。微波提取經清洗、粉碎、浸泡、微波、分離、濃縮、干燥、粉化后得到提取物[9]，常用于提取黃酮類、苷類、萜類、有機酸、生物堿等中藥有效部位。劉丹彤等[10]在提取暖心方（紅參、熟附子、薏苡仁、橘紅）時采用單因素實驗法發現，微波提取有效成分最佳條件為功率1200 W、提取時間40 min、提取次數1次。對比其他提取法，微波提取工藝能縮短提取時間，節省物料成本，且有利于中藥復方的提取。但微波提取只適用于對熱穩定的有效成分，對于熱敏性物質，微波加熱可導致其變性失活[11]。所以，在應用微波提取時需要考慮溶劑類型、提取時間、提取溫度、含水量、微波功率等因素影響。

1.5 大孔樹脂吸附法

大孔吸附樹脂通過表面系數、表面電性、形成氫鍵，選擇性吸附中藥內有機化合物，具有選擇性好、穩定性高、干擾因素少、可循環重復利用等特點，被廣泛應用于分離中藥中有效部位和有效成分[12]。陳雪楓等[13]采用D101型大孔吸附樹脂對九味羌活湯不同溶劑提取物進行分離純化，以總化合物數量及固形物得率為純化指標，分別考察上樣量、濃度、洗脫濃度等因素對分離純化效率的影響，結果表明，大孔樹脂吸附法分離、純化九味羌活湯有效部位合理、穩定、可行。劉飛等[14]通過抗病毒實驗，篩選佩蘭最佳提取方法發現，AB-8弱極性大孔吸附樹脂對佩蘭的分離純化效果最佳，其體積分數25%乙醇洗脫部位的T1值可達127.001，是佩蘭抑制腸道EV-71病毒的最佳有效部位。但大孔樹脂的吸附作用具有選擇性，對水溶性成分的分離效果明顯，對糖類、色素的吸附作用較弱，在實際應用中有局限性。

1.6 超濾膜分離法

超濾膜分離技術是近年來發展起來的一種高效、節能、無污染分離技術，過程簡單，不存在相的轉換，能最大限度保持成分穩定，因此在現代中藥生產領域廣泛應用[15]。劉力等[16]對白芍水提液有效部位進行PVC超濾膜分離研究，通過不同孔徑的超濾膜過濾分離白芍水提液，取過濾前后的處理液用高效液相色譜法分析有效成分白芍總苷含量，結果顯示，大孔徑超濾膜超濾后濾液中白芍總苷含量明顯高于原液。

2 有效部位篩選

對于中藥活性的傳統鑒別手段，主要是形態學、組織學、細胞遺傳學和化學方法。但中藥有效部位既包含有效成分，又含有未闡明的活性成分[17]，而運用現代技術手段既能確定中藥有效部位的藥效物質基礎，又能明確中藥其他部位的藥效物質基礎[18]。

2.1 基于體內生理功能篩選中藥有效部位

有效部位是中藥中具有相似化學性質的一大類化合物，而多個有效部位的集合就成為中藥藥效組分群。由于中藥的復雜性及現代研究手段的局限性，目前尚無法全面概括中藥的化學成分，而有效部位研究能在一定程度上明確中藥發揮藥效的物質基礎。多指標分析體內代謝及生理功能也是追蹤篩選中藥有效部位的方法之一。龐漢青等[19]通過測定血瘀模型大鼠血液流變學、凝血功能等指標，發現丹參不同有效部位均能改善血瘀大鼠血液流變學及凝血功能，以丹參總酚酸和丹參總酮聯合使用效果最優。

2.2 基于成分敲出技術篩選中藥有效部位

中藥成分敲出（撤出）技術，即研究中如果去除某一部分或某一味藥后對藥效影響很大，表明該成分或藥味是發揮藥效的關鍵成分；反之，表明該成分或藥味可用其他類似藥物替代，或與其他組分不產生協同作用。黃偉強等[20]通過動物實驗驗證葛根抗腹瀉組分為葛根素、大豆苷、大豆苷元及3’-羥基葛根素，其有效組分抗腹瀉的標準物質與葛根具有等效性，并且發現葛根、葛根有效組分及經方均可有效抑制番瀉葉引起的小鼠腹瀉頻次，同時發現葛根芩連湯組與去葛根芩連湯組療效無顯著差異，表明葛根活性成分與葛根在組方中具有相同作用。

2.3 基于譜-效關系篩選中藥有效部位

中藥譜-效研究過程是先通過合適的化學分析手段最大程度表征中藥的化學信息，將中藥指紋圖譜中化學信息與體內外藥效結果結合起來，采用合適的數據處理技術將“譜”與“效”聯系起來，找出與藥效活性相關的有效部位或有效部位群，常用于中藥物質基礎研究[21]。周婷婷[22]通過建立磨盤草正丁醇部位指紋圖譜及抗炎效果觀察，發現磨盤草正丁醇部位對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹及棉球肉芽腫慢性炎癥均有明顯抑制作用，指紋圖譜比較分析顯示，正丁醇部位有效成分除來自原藥材的原型成分，還來源于小鼠代謝產物與應激刺激。劉小花等[23]將黃芪指紋圖譜與小鼠利尿藥效相關聯進行比較，篩選出黃芪乙酸乙酯部位為有效部位，乙酸乙酯部位利尿作用是其所有化學成分共同作用的結果，且該部位富含中等極性的黃酮類化合物，能顯著提高小鼠排尿量，其指紋圖譜與利尿作用有一定對應關系。目前，表征化學成分指紋圖譜技術存在一定局限性，亟待發展多種先進技術或多技術聯用，以期盡量全面表征；藥效指標選擇應體內外實驗相結合；而用于關聯譜-效的數理統計方法應依據數據類型合理選擇，必要時多種方法相互佐證，以保證結果準確可靠。

2.4 基于體外模型細胞膜親和色譜篩選中藥有效部位

生物色譜技術作為一種新型的技術用于中藥活性部位的篩選，主要包括分子生物色譜和細胞膜色譜，是通過藥物與大分子蛋白或細胞相互作用，達到分離、純化和篩選活性的目的。其中細胞膜色譜是近年來中藥領域研究的熱點，其依據提取物的成分與活性細胞是否具有特異親和能力而進行藥效成分分離和鑒定，親和力高的成分即藥效物質基礎。侯曉芳等[24]利用細胞膜色譜法并結合離體藥理實驗，對四物湯中進行拆方分析，發現川芎醇提后醋酸乙酯萃取部位是川芎發揮藥效有效部位，在此基礎上建立了以川芎有效部位為基礎的高效毛細管色譜指紋圖譜分析方法和高效液相色譜指紋圖譜分析方法。體外細胞膜色譜法能快速有效地對中藥有效部位和活性成分進行初步篩選，為中藥高通量篩選提供途徑；與分子生物色譜相比，更具有整體性，更能體現中藥成分的復雜性。然而，在篩選過程中，活性成分可能與功能性受體及非功能性受體相結合，篩選出的活性成分不能很好代表中藥發揮藥效的物質基礎，需進一步研究。

2.5 基于網絡藥理學研究中藥有效部位

近年來，網絡藥理學成為中藥研究熱點，其系統性和整體性為中藥活性成分篩選研究提供新思路。網絡藥理學是在“疾病-基因-靶點-藥物”的基礎上，采用網絡拓撲分析方法預測藥物發揮藥效的活性成分[25]，常用的網絡藥理學數據庫有 Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine（TCMIP）、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）、Traditional Chinese Medicine Database等。其中，TCMSP是Ru等[26]在中藥系統藥理學框架基礎上，建立的中藥系統藥理數據庫與分析平臺，將中藥活性部位、藥物靶點、相關疾病可視化，自動建立中藥活性物質、藥物靶點和目標疾病的網絡分析，為闡明中藥靶點網絡、發現中藥關鍵活性物質提供了基礎，并得到廣泛運用。網絡藥理學利用計算機網絡學科的語言，將復雜的生物系統相互作用抽象表達為網絡，如何構建符合中藥多成分、多靶點的復雜關系仍是研究難點。

2.6 基于功能蛋白質組學技術篩選中藥有效部位

活性蛋白組學技術是研究復雜蛋白質組中酶活性的技術，是使用基于活性的化學探針將特定酶的活性形式可視化，確定中藥活性成分在細胞內的蛋白質靶點。近年來，越來越多中藥活性小分子探針被合成。Dai等[27]通過對黃酮類化合物黃芩苷進行定量化學蛋白質組學分析，合成基于黃芩苷活性的探針，確定肉堿棕櫚轉移酶1是黃芩苷的關鍵靶點，而黃芩苷能顯著降低脂質累積，有效改善因飲食誘導的肥胖及肝臟脂肪變性相關癥狀。

2.7 基于腸道菌群技術篩選中藥有效部位

近年來，腸道菌群逐漸成為中藥活性成分的研究熱點。中藥通過口服進入消化道，一部分直接通過胃黏膜吸收入血，另一些生物利用度較低的部分未經上消化道吸收，通過小腸到達大腸，與腸道菌群接觸并發生相互作用，中藥有效部位成分不僅能改變腸道菌群代謝，且被腸道菌群轉化或代謝[28]。Yue等[29]通過對模型小鼠糞便樣品中細菌16S rRNA進行測序分析，發現不易吸收入血的異喹啉類生物堿小檗堿能參與腸道菌群支鏈氨基酸的合成與代謝，改善胰島素抵抗，并且能降低模型小鼠及糖尿病患者血清腸道菌群支鏈氨基酸水平。由于腸道內活性成分是藥物被吸收代謝后進入腸道，加之腸道內容物復雜，因此，腸道菌群中活性物質還需要藥效學驗證，或聯合多組學分析推測代謝物的變化。

3 小結及展望

目前，中藥有效部位的復雜性限制其臨床應用。主要體現在：①中藥是多種不同成分在不同時間段協同作用時發揮藥效，具有時-效性；②中藥炮制方法不同，其有效成分及功效不同，如生黃連、酒黃連、姜黃連和萸黃連，炮制方法不同，功效也有所不同；③中藥經體內代謝、腸道菌群代謝會產生新成分[30]；④具有多方向功效類集的中藥往往藥材本身所含活性成分含量較低，藥效呈量效性，但現代分析檢測技術無法全面檢測中藥有效部位，有些成分可能至今尚未發現，使其作用被忽視，缺乏合理的動物模型用于藥效物質基礎的篩選[31]。中藥有效部位研究是中藥現代化開發的有效思路之一，近年來，隨著現代科技與計算機技術的不斷發展，有效部位的提取分離、純化技術不斷完善，新技術、新設備層出不窮，但如何提高有效部位提取率及環保節能的提取制備法仍是今后研究的方向；其次，盡管中藥有效部位追蹤篩選技術在不斷提升，中藥有效部位在新檢測技術、多組學分析、多種生物學效應評價等方面也取得進展，但認識到中藥是多成分、多靶點、多途徑作用于機體，單一檢測方法有一定局限性，運用多學科聯合篩選方法更能體現中醫藥的全面觀、整體觀[31]，也是中藥有效部位研究的趨勢。