咖啡腐皮鐮孢黑果病病原鑒定及其生物學特性測定

朱孟烽　吳偉懷　賀春萍　梁艷瓊　陸英　習金根　莫麗珍　譚施北　易克賢

摘 ?要：本文針對云南咖啡園在雨季出現的一種咖啡果實變黑的黑果病害進行病原菌分離，獲得CPE5和CPE12菌株。這2個菌株在PDA培養基上菌落呈圓形，氈狀，菌絲體灰白色，表面稀疏，背面出現淺黃色色素。分生孢子具1～8個隔膜，長6.08～65.3 ?m，寬2.76～9.03 ?m。小型分生孢子呈腎形，大型分生孢子鐮刀型。致病性測定表明，無論是接種健康新鮮的咖啡離體葉片還是果實，產生的癥狀以及再分離后獲得的分生孢子形態特征均與初始接種菌株的一致。分子鑒定結果表明，無論是ITS、β-tubulin、TEF、28S rDNA單個基因聚類樹，還是ITS-TEF加合基因序列聚類結果均一致，表明菌株CPE5與CPE12均屬于腐皮鐮孢（Fusarium solani）。這是國內腐皮鐮孢危害咖啡果實的首次報道。病原菌的生物學特性研究表明，咖啡腐皮鐮孢菌最適宜生長的培養基是PDA和玉米粉瓊脂培養基;最適生長溫度為28 ℃;完全光照有利于病原菌的生長。病原菌對碳源甘露醇以及氮源牛肉浸膏、甘氨酸、尿素利用率最高;菌株在75 ℃，10 min條件下即可致死。咪鮮胺錳鹽和戊唑醇2種藥劑的EC50值分別為1.8352 ?g/mL和1.4826 ?g/mL，對菌株CPE5菌絲體生長具有十分顯著的抑制效果。

關鍵詞：咖啡;腐皮鐮孢;分子鑒定;生物學特性

中圖分類號：S435.712 ? ? ?文獻標識碼：A

Identification and Biological Characteristics of Fusarium solani Causing Coffee Black Berry Disease

ZHU Mengfeng1， WU Weihuai2*， HE Chunping2， LIANG Yanqiong2， LU Ying2， XI Jingen2， MO Lizhen3， TAN Shibei2， YI Kexian2*

1. School of Life Science and Pharmacy， Hainan University， Haikou， Hainan 570288， China; 2. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101; 3. Yunnan Puer Tea and Coffee Industry Development Center， Puer， Yunnan 665000， China

Abstract： In this study， the pathogen was isolated from an unknown disease in the coffee garden in Yunnan， which can darken the coffee berry. Two strains， CPE5 and CPE12 were obtained. The strains had a round， felt-like colony on PDA medium， the mycelium was off-white， the surface was sparse， and light yellow pigment appeared on the back. The conidia had 1-8 septums， its length was 6.08-65.3 ?m and width was 2.76-9.03 ?m. Small conidia were kidney-shaped and large conidia were sickle-shaped. The pathogenicity test showed that no matter whether inoculating healthy fresh coffee leaves or fruits， the symptoms and the morphological characteristics of the conidia obtained after re-isolation were consistent with the original inoculated strains. Molecular identification results showed that ITS， β-tubulin， TEF， 28S rDNA， four single gene clustering tree， and ITS-TEF adduct gene sequence clustering results were consistent， indicating that CPE5 and CPE12 belong to Fusarium solani. This is the first report that Fusarium solani harms coffee berry. Studies on the biological characteristics of the pathogen showed that the most suitable growth media were PDA and corn flour agar medium， the optimum growth temperature was 28 ℃， full light was conducive to the growth. The strains had the highest utilization rate of carbon source mannitol and nitrogen source beef extract， glycine， and urea. The strains could be sterilized at 75 ℃ for 10 minutes. The EC50 values of prochloraz manganese salt and tebuconazole were 1.8352 g/mL and 1.4826 g/mL， respectively， which had a very significant inhibitory effect on the growth of CPE5 mycelium.

Keywords： coffee; Fusarium solani; molecular identification; biological characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.030

咖啡曾經作為世界貿易價值僅次于石油的商品[1]，與可可、茶葉并稱為世界三大飲料。咖啡具有很高的經濟價值和營養價值，居世界三大飲料之首[2]。目前，我國咖啡種植區域主要集中于云南省和海南省，西藏、福建、四川、廣西、廣東等省（區）也有少量種植。據農業農村部統計，2018年我國咖啡總面積12.27萬hm2，其中云南占99.22%，海南占0.37%。與此同時，近年來我國也逐漸成為咖啡消費大國，咖啡消費量正以每年超過20%的速度增長[3]。目前，我國咖啡消費市場規模約1000億元，與美、日等發達國家相比，我國的咖啡消費仍處于初期階段。2016年，我國咖啡出口創收5.28億美元[4]，可見我國咖啡產業具有良好的發展前景。

然而，隨著咖啡種植面積的擴大，以及品種、種苗的不斷引進與調運，導致咖啡生產過程中病害頻繁發生，嚴重影響和制約咖啡產業的健康發展[5-9]。咖啡黑果是小粒種咖啡產區普遍出現的一種癥狀，嚴重影響小粒種咖啡的產量與質量[10-11]。產生黑果的原因也有多種，既有生理因素引起的枝枯干果，也有蟲害、病害所引起的黑果[10-12]。而在病害方面，根據對云南省普洱市思茅區咖啡黑果病的調查結果表明，咖啡生尾孢菌、咖啡炭疽病菌以及擬束梗鐮刀菌（Fusarium stilboides）均可導致咖啡黑果[10]，但該文中未見柯赫氏法則等相關內容。

2018年夏季，云南普洱由于連續降雨，導致大量咖啡果實變黑，嚴重影響產量，初步判斷是由病害引起，但未鑒定其病原菌。為了鑒定該病害的病原及其發生規律，本研究在分離獲得病樣分離物的基礎上，通過致病性測定、形態學觀察并結合多基因序列的分子鑒定，以明確引起咖啡黑果的病原菌，并對其生物學特性進行研究，為該病害的預測與防治提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株 ?從云南普洱南島河咖啡種植區收集典型病樣，通過分離純化獲得單孢菌株CPE5與CPE12，菌株保存于中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所。

1.1.2 ?試劑 ?本研究所用的PCR擴增引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司使用普通脫鹽方法合成;Premix Taq購自TaKaRa;真菌DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒為OMEGA公司試劑產品;用于連接轉化的大腸桿菌Trans-T1感受態細胞以及pEASY-T1 Cloning Kit均購自北京全式金生物試劑公司。所用其余試劑均為國產分析純。

1.2 ?方法

1.2.1 ?病原菌分離與形態觀察 ?從種植地采集的病果經過表面清洗后，將果皮剪成4～6 mm2大小，在超凈工作臺進行表面消毒，然后轉移至PDA培養基。待長出新鮮菌絲后，轉入新的PDA培養基。純化培養7 d后對其菌落形態進行拍照。用無菌鐵勺刮去培養基表面氣生菌絲，于超凈臺晾曬2 d后用無菌水沖洗表面，制成孢子懸浮液，并在顯微鏡（日本Nikon NI/E）40倍鏡下對200個分生孢子形態、大小等進行觀察、測量與記錄。

1.2.2 ?病原菌致病性測定 ?采用2種方式進行致病性測定。（1）摘取健康咖啡新鮮嫩葉，通過微刺傷后接種2個菌絲塊，并以無菌PDA為對照，各接種3片葉;25 ℃保濕培養，6 d后觀察發病情況;（2）取田間健康的咖啡果實洗凈，通過微創傷后接種孢子懸浮液（1×107個/mL），并以接種清水為對照。各接種3個果實。25 ℃保濕培養，定期觀察。待發病后進行拍照保存，并對發病部位組織進行再分離。

1.2.3 ?菌絲體培養、收集以及DNA提取 ?將病原菌在PDA平板上預培養3 d，在超凈工作臺挑取3個約0.5 cm2大小的新鮮菌絲塊接種到經高溫高壓滅菌的酵母液體培養基（每升培養基含1%葡萄糖，0.3%酵母粉）。經180 r/min，28 ℃，搖菌培養4～5 d。用紗布過濾，無菌水沖洗3～5次，濾紙吸去多余水分收集菌絲體，經凍干機將菌絲體干燥。利用OMEGA真菌提取試劑盒提取病原菌DNA，-20 ℃冷凍備用。

1.2.4 ?病原菌分子鑒定 ?采用ITS1/ITS4（ITS基因）、T1/T22（編碼蛋白基因β-微管蛋白，β-tubulin）、EF1H/EF2T（真核生物延伸生長因子基因，TEF）、LROR/LR5（28S rDNA基因）共4對引物對病原菌進行分子鑒定，具體序列見表1。擴增程序為：94 ℃下預變性3 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環后72 ℃延伸10 min，反應結束后置于4 ℃冰箱保存。擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠檢測并回收。回收產物連接pMD18T載體，并于大腸桿菌克隆。挑取單菌落進行分子鑒定，選取3個陽性克隆子于英濰捷基（廣州）貿易有限公司測序。

1.2.5 ?序列分析 ?將測序獲得菌株的ITS、β-tubulin、TEF和28S rDNA基因片段序列與從GenBank中下載的菌株（部分為模式菌株）序列，使用DNAStar Seqman軟件進行對齊，并通過人工校對后，使用MEGA 7.0軟件進行比對分析，分別構建基于ITS、β-tubulin、TEF、28S rDNA單個基因序列的系統發育樹。其中ITS和TEF基因序列進一步用于構建雙基因加合樹。用于構建發育樹的菌株相關信息見表2。

1.2.6 ?病原菌生物學特性測定 ?（1）營養因子測定。分別測定不同培養基、碳源、氮源等對病原菌生長的影響。選用PDA培養基、玉米粉瓊脂培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、薩氏培養基、Czapek培養基、燕麥粉瓊脂培養基為參試培養基;碳源、氮源則采用Czapek培養基作為基礎培養基，將該培養基的硝酸鈉分別使用等氮當量的牛肉浸膏、半胱氨酸、甘氨酸、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、尿素代替;以及使用等碳當量的麥芽糖、果糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉代替蔗糖;從而配制成不同的碳源、氮源培養基。利用滅菌打孔器（d=5 mm），在PDA平板預培養7 d的病原菌邊緣打取菌塊，接種于上述培養基中，于28 ℃培養7 d后測量菌落直徑。各處理均重復3次。

（2）非營養因子測定。分別測定溫度、pH、光照條件以及病原菌的致死溫度等非營養因子。溫度試驗共設4、13、20、25、28、30、37 ℃等7個梯度，培養7 d;光照試驗設24 h光照，12 h/12 h光照/黑暗，24 h全黑暗條件，置于28 ℃恒溫培養箱培養7 d;pH試驗則設3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0共9個梯度，置于28 ℃培養7 d。采用十字交叉法測量菌落直徑。病原菌致死溫度測定：通過在2 mL的離心管中加入1 mL的無菌水，在離心管中加入菌餅（d=5 mm），并分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃溫度水浴10 min（預熱1 min）后，接種到PDA平板培養基上，置于培養箱中28 ℃培養，7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。各處理均重復3次。

1.2.7 ?病原菌藥劑敏感性測定 ?利用12種供試殺菌藥劑（表3），配制不同濃度的含藥劑平板，將培養好的CPE5病原菌菌塊（d=5 mm）接于含藥劑平板的中心，每個濃度設置5個重復，置于28 ℃恒溫培養箱培養7 d，用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算生長抑制率，分析不同殺菌劑對供試病菌菌絲體生長的影響。

1.3 ?數據處理

采用SPSS 13.0分析軟件和Excel軟件進行試驗數據的統計分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?病害癥狀及病原菌的形態特征

該病原菌主要危害咖啡果實，感病果實變藍黑色，由果柄向果蒂逐漸蔓延，最后發展至全果（圖1A）。通過常規分離法分離獲得分離物CPE5、CPE12，分離物在PDA上生長迅速，培養7 d后，菌落呈圓形，氈狀，菌絲灰白色，表面稀疏（圖1B），背面出現淺黃色色素（圖1C）。分生孢子有1～8個隔膜，長6.08～65.3 ?m，寬2.76～9.03 ?m;小型分生孢子呈腎形，大型分生孢子若紡錘形，兩端尖（圖1D）。

2.2 ?致病性測定

挑選健康無機械損傷的小粒種咖啡葉片，進行微刺傷后接種2個菌絲塊，用無菌PDA作為對照。6 d后，接種葉片表面出現感病癥狀，病斑邊緣呈現黃色，病斑中心為黑色，而其對照則無任何發病跡象（圖2A）。而孢子懸浮液接種健康的咖啡果實7 d后，刺傷處顏色由褐變黑，局部伴有白色霉點（圖2B），而其對照亦無任何感病癥狀（圖2C）。再分離的病原菌分生孢子與原接種菌一致（圖2D）。由此可判斷所分離的病原菌為致病菌。

2.3 ?分子鑒定

采用ITS1/ITS4、T1/T22、EF1H/EF2T、LROR/LR5共4對引物對病原菌進行分子鑒定，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測分別獲得568、1332、743、925 bp的片段。將上述序列分別在GenBank數據庫中進行同源性搜索，下載同源性較高的菌株序列，與本研究的菌株CPE5和CPE12的序列構建Neighbor-joining Tree。由于數據庫中序列長度存在差異，使用Seqman軟件進行比對并手工校正，最終用于構建發育樹的目的菌株ITS、β-tubulin、TEF、28S rDNA序列分別為464、1323、614、870 bp。基于不同序列構建的單基因系統發育樹存在一定的差異（由于篇幅所限，單基因發育樹未在文中列出）。在ITS序列系統發育樹中，CPE5、CPE12與Fusarium solani JF740882和F. solani JF740931菌株聚類為一支。在β-tubulin序列系統發育樹中，CPE5、CPE12與F. solani KU983876、F. solani KF255996聚類成一個分支;TEF序列系統發育樹顯示，CPE5、CPE12與F. solani JF740846、F. solani DQ247538菌株聚類為一支;而在28S rDNA序列系統發育樹中，CPE5、CPE12則與F. solani MH875874菌株雖然聚類在同一分支，但只有91%的節點支持率。由于上述基因序列的缺失，本研究僅通過將ITS與TEF基因序列拼接，構建雙基因加合樹。聚類結果顯示，CPE5、CPE2與F. solani NRRL52778、NRRL25083菌株聚類成一個分支，且其節點支持率為100%（圖3）。綜合上述，由ITS、β-tubulin、TEF、28S rDNA四個單基因系統發育樹以及ITS和TEF的雙基因加合樹，可得出CPE5和CPE12屬于腐皮鐮孢（Fusarium solani）。

2.4 ?咖啡腐皮鐮孢菌生物學特性

2.4.1 ?營養因子對咖啡腐皮鐮孢菌生長的影響 ?營養因子測定結果表明，菌株CPE5在供試的6種培養基上均能生長，最適宜生長的培養基是PDA和玉米粉瓊脂培養基，其菌落平均直徑分別為76.17 mm和71.58 mm;牛肉膏蛋白胨培養基、燕麥粉瓊脂培養基的效果次之，菌落平均直徑分別為66.5 mm和64.17 mm;其余培養基生長效果則較差（篇幅所限，數據未列出。下同）。在供試的7種不同碳源培養基中，以甘露醇的利用率最高，培養7 d后病原菌菌落平均直徑為79.17 mm，顯著高于其他碳源培養基;其次為果糖，菌落平均直徑為74.83 mm;蔗糖和乳糖的碳源利用率最差，無顯著差異，平均菌落直徑為52.5 mm和51.33 mm。在供試的8種不同含氮培養基上，利用率較高的是牛肉浸膏、甘氨酸、尿素，菌落平均直徑依次為77.00、79.17、76.5 mm，三者之間無顯著差異;其次為半胱氨酸和氯化銨，平均菌落直徑為64.00 mm和65.17 mm;利用率最低的為含硝酸銨的培養基，菌絲極稀薄，不易用肉眼觀察。

2.4.2 ?非營養因子對咖啡腐皮鐮孢菌生長的影響 ?非營養因子測定結果表明，病原菌可在13～30 ℃的環境下生長，在4 ℃以及37 ℃的環境下，病原菌不能生長;適宜生長溫度為25～30 ℃，最適生長溫度為28 ℃，菌落平均直徑顯著大于其他處理;溫度小于25 ℃的條件下病原菌的生長受到抑制。菌株在中性及偏堿性的環境下生長明顯快于偏酸性環境，當pH<3時菌株的生長受到抑制。完全光照有利于病原菌生長，其次為12 h光暗交替，在完全黑暗條件下不利于菌株菌絲的生長。菌餅在70 ℃水浴10 min后，在28 ℃環境下依舊能正常生長，但在75 ℃下水浴后菌落不生長。所

以CPE5菌株的致死溫度和致死時間分別為75 ℃和10 min。

2.5 ?病原菌室內毒力測定

室內毒力測定結果顯示，咪鮮胺錳鹽和戊唑醇2種藥劑的EC50值分別為1.8352 g/mL和1.4826g/mL，對CPE5菌株菌絲體生長具有十分顯著的抑制效果。而氟菌戊唑醇、嘧菌酯、百菌清等3種藥劑對病原菌的抑制效果次之，EC50值分別為4.7226、2.8080、2.7433 g/mL;此外，丙環唑、氟環唑也有較強的抑制效果，EC50分別為9.0377、6.9998 g/mL。其中，啶氧菌酯與春雷霉素對該病原菌的抑制效果最差，EC50值分別為7405.9907、9522.0294g/mL，基本無抑制效果。12種不同的殺菌劑對腐皮鐮孢菌的抑制效果存在差異（表4）。

3 ?討論

鐮刀菌屬（Fusarium ssp.）是世界上分布范圍很廣的一類真菌，可侵染多種作物，引起根腐病、莖腐病等癥狀。鐮刀菌屬種類繁多，部分鐮刀菌存在多個專化型，以及種間差異，加上多種形態，給鑒定分類帶來很大的困難。僅依靠形態學鑒定無法很好地區分種類。目前應用于鑒定鐮刀菌的基因位點主要有ITS、TEF、β-tubulin、28S rDNA，以及線粒體小亞基核糖體（mtSSU）、組蛋白（H3）、鈣調蛋白（calmodulin）等[18]。如林珊宇等[19]使用rDNA-ITS序列鑒定出引起火龍果軟腐病的病原菌是木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）;楊波等[20]利用引物對EF1H/EF2T擴增目的片段，結合形態學鑒定出引起新疆馬鈴薯根腐病的病原菌為銳頂鐮刀菌等5種不同的鐮刀菌。張曼等[21]使用ITS基因序列和EF1-α基因序列相結合確定引起葫蘆砧木萎蔫病的病原菌是腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）;張貞明等[22]使用引物對Fu3/Fu4確定引起甘肅省武威市苜蓿根腐病的病原菌是半裸鐮孢菌、厚垣鐮孢菌、層出鐮孢菌3種致病菌。

本研究通過采用ITS、TEF、β-tubulin、28S rDNA四個單基因對從咖啡黑果病樣上分離獲得的病原菌進行分子鑒定，并且構建ITS與TEF基因的加合樹，綜合分析確定該病原菌為腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）。盡管，目前已有報道多種危害咖啡漿果的病害，如由卡哈瓦刺盤孢（Colletotrichum kahawae）引起的咖啡果疫病[23];由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloesporioides）引起的褐疫病[24];以及咖啡生尾孢（Cercospora coffeicola）危害咖啡漿果發病[25]，引起暗紅褐色、皰狀病斑引起的皰斑病等。經過查詢文獻資料，目前國內尚無腐皮鐮孢菌危害咖啡果實的報道，本研究為首次報道。

對于一種新病害，明確其生物特性，是開展監測預警及其防治的前提條件。生物學特性研究結果顯示，病原菌可在13～30 ℃的環境下生長，在4 ℃以及37 ℃的環境下，病原菌不能生長;最適生長溫度為28 ℃。完全光照有利于病原菌生長。最適宜CPE5生長的培養基是PDA、玉米粉瓊脂培養基;病原菌對碳源甘露醇利用率最高，蔗糖和乳糖利用率最差;對氮源利用率最高的是牛肉浸膏、甘氨酸、尿素，最差的是硝酸鈉和硝酸銨，但在含硝酸銨的平板上菌絲極稀薄;CPE5菌株的致死溫度和致死時間分別為75 ℃和10 min。與楊靜美等[26]在番木瓜上分離到的F. solani生物學特性相似。咪鮮胺錳鹽、戊唑醇2種藥劑對病原菌的抑制效果最好。需要注意的是，咖啡黑果可由生理、病理、蟲害等多方面原因引起，本研究所鑒定的腐皮鐮孢菌（F. solani）只是其中病原之一。故在生產中，首先需要明確其病因，才能有的放矢地對其進行防治。

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責任編輯：謝龍蓮

收稿日期 ?2020-05-05;修回日期 ?2020-06-16

基金項目 ?國家重點研發計劃項目（No. 2018YFD0201100）;中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項資金項目（No. 1630042017021）;FAO/IAEA合作研究項目（No. 20380）。

作者簡介 ?朱孟烽（1995—），男，碩士研究生，研究方向：咖啡病害監測與防治。*通信作者（Corresponding author）：吳偉懷（WU Weihuai），E-mail：weihuaiwu2002@163.com;易克賢（YI Kexian），E-mail：yikexian@126.com。