調控萼脊蘭類黃酮生物合成的MYB轉錄因子挖掘分析

蔣素華　牛蘇燕　袁秀云　梁芳　王喜蒙　崔波

摘 ?要：本研究通過生物信息學方法，挖掘萼脊蘭中可能調控類黃酮生物合成的MYB轉錄因子。從萼脊蘭轉錄組數據庫中篩選MYB轉錄因子，獲得MYB的完整ORF，并對其蛋白理化性質、基序、功能注釋、系統進化、表達特性等進行分析，并預測其功能。結果表明：在萼脊蘭轉錄組水平上共鑒定出27個具有完整閱讀框的MYB轉錄因子基因，萼脊蘭MYB轉錄因子TRINITY_DN38485_c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1基因均在花朵和葉片中表達上調，再根據與蝴蝶蘭的系統進化關系與功能分析，預測這2個轉錄因子可能通過黃酮途徑完成類黃酮生物合成。因此，MYB轉錄因子的研究對從分子水平上研究和調節類黃酮的合成具有重要意義，轉錄因子的應用是類黃酮生物合成基因工程中的新途徑。

關鍵詞：萼脊蘭;MYB轉錄因子;次生代謝

中圖分類號：Q946.8 ? ? ?文獻標識碼：A

Mining Analysis of MYB Transcription Factors Related to Flavonoid Biosynthesis of Sedirea japonica

JIANG Suhua1， NIU Suyan1， YUAN Xiuyun1， LIANG Fang1， WANG Ximeng2， CUI Bo1*

1. Biological Engineering Research Center， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou， Henan 450044， China; 2. College of Life Sciences， Zhengzhou University， Zhengzhou， Henan 450002， China

Abstract： MYB transcription factors that may regulate the biosynthesis of the flavonoids in Sedirea japonica were detected using bioinformatics methods. The complete ORF of MYB was obtained， and the physicochemical properties， motif， functional annotation， phylogenetic evolution， and expression characteristics of its proteins were analyzed， and its functions were also predicted. A total of 27 MYB transcription factor genes with complete reading frames were identified at the transcriptome level of S. japonica. MYB transcription factors TRINITY_DN38485_c0_g4 and TRINITY_ DN38485_c0_g1 were up-regulated in flowers and leaves. Then according to the phylogenetic relationship with phalaenopsis and functional analysis，it is predicted that the two transcription factors were involved in flavonoid biosynthesis through the flavonoid pathway. Therefore， the study of MYB transcription factor is of great significance to study and regulate the synthesis of flavonoids at the molecular level. The application of transcription factors is a new approach in the genetic engineering of flavonoid biosynthesis， the application of transcription factors is a new approach in the genetic engineering of flavonoid biosynthesis.

Keywords： S. japonica; MYB transcription factors; secondary metabolism

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.003

轉錄因子（transcription factor）是一群能與基因5? 端上游特定序列專一性結合，從而保證目的基因以特定強度在特定時間與空間表達的蛋白質分子。根據轉錄因子的作用特點可分為兩類：第一類為普遍轉錄因子;第二類轉錄因子為組織細胞特異性轉錄因子[1-2]。人們在植物中已經找到了很多調控黃酮類次生代謝的特異性轉錄因子基因，主要包括編碼MYB、MYC、bZIP、WD40蛋白和鋅指蛋白等基因家族[3-4]。MYB基因家族廣泛存在于植物中，是植物中最大的轉錄因子基因家族之一。在類黃酮生物合成過程中，MYB轉錄因子扮演著重要角色，可調控與類黃酮合成相關的酶基因的表達，從而有效地調控類黃酮物質的生物合成。根據MYB的DNA結合結構域中不完全重復序列的數目將其分為4個亞類：1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB。其中，R2R3-MYB是MYB轉錄因子家族中最大的亞類，其在類黃酮合成中的作用已被廣泛研究[5-6]。目前擬南芥、水稻和小蘭嶼蝴蝶蘭的MYB轉錄因子的數據庫已經建成，為其他蘭科植物的研究打下了良好的基礎。

類黃酮在植物中廣泛存在，并廣泛參與植物中花色素的形成、花香的調節、抗病、抗紫外線損傷等多種生物學過程[7]。李崇暉等[8]對不同顏色的蝴蝶石斛蘭品種花朵中的類黃酮組成進行分析，推測了蝴蝶石斛蘭花中的類黃酮代謝途徑。鐘淮欽等[9]克隆了類黃酮-3?5?-羥基化酶基因（F3?5?H），并對該基因進行了表達分析。張加強等[10]鑒定了蝴蝶蘭花色苷合成的相關基因，從轉錄組水平揭示蝴蝶蘭花色苷生物合成的分子調控機制，結果顯示類黃酮生物合成中差異基因為8個，綜上所述，關于類黃酮代謝途徑及相關基因研究的較多，而類黃酮合成相關的MYB轉錄因子在植物優良性狀形成及微量次生代謝物的合成中的調控研究還較少。

萼脊蘭（Sedirea japonica）為蘭科（Orchidaceae）萼脊蘭屬（Sedirea Garay & H. R. Sweet）多年生植物，總狀花序從葉腋中發出，花具橘子香氣，花多且花期長，因此研究類黃酮對萼脊蘭花香的調節具有重要意義。目前還未見萼脊蘭MYB轉錄因子家族基因的研究報道，本研究基于測序的萼脊蘭轉錄組數據庫信息，篩選并鑒定出萼脊蘭所有MYB轉錄因子，并對其進行理化性質分析、蛋白基序分析、系統發育樹構建以及基因表達分析，這些結果為進一步探索萼脊蘭MYB基因提供理論資料。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

萼脊蘭采自鄭州師范學院觀賞、藥用蘭花河南省重點實驗室蘭花種植基地。萼脊蘭MYB轉錄因子是本實驗室構建的轉錄組數據庫。蝴蝶蘭MYB轉錄因子家族氨基酸序列下載于蝴蝶蘭信息資源（PlantTFDB）數據庫（http：//planttfdb. cbi.pku.edu.cn/quick_search_result.php）。

1.2 ?萼脊蘭MYB轉錄本篩選

高通量測序由上海生工生物科技有限公司完成，拼接組裝后獲得萼脊蘭轉錄組，采用轉錄組基因ID搜索獲取氨基酸序列，使用ORF Finder在線軟件分析預測開放閱讀框（ORF），獲得具有全長氨基酸序列的萼脊蘭MYB轉錄因子家族蛋白基因序列。

1.3 ?蛋白基序分析、結構預測、GO注釋

運用The MEME Suite 4.12.0程序分析萼脊蘭MYB家族蛋白的基序;應用結構域在線分析軟件PROSITE和SMART對保守結構域進行分析。選擇具有完整ORF的萼脊蘭MYB轉錄因子氨基酸序列，利用在線工具ProtParam對蛋白進行理化性質分析;利用在線軟件SOPMA對蛋白二級結構進行預測分析。使用BLAST2GO軟件對篩選獲得的萼脊蘭MYB轉錄因子進行功能注釋分析。

1.4 ?系統進化樹構建及功能分析

蝴蝶蘭MYB轉錄因子的蛋白序列從PlantTFDB數據庫中下載，完整的氨基酸序列用于進化分析。利用Clustal X程序和MEGA4對萼脊蘭MYB家族蛋白的氨基酸序列和下載的蝴蝶蘭所有MYB轉錄因子的蛋白序列進行比對分析，將比對結果采用鄰接法構建系統發育樹。

通過萼脊蘭MYB轉錄因子與蝴蝶蘭所有MYB轉錄因子構建的系統進化樹，篩選獲得與各個萼脊蘭MYB轉錄因子相似性最高的蝴蝶蘭MYB轉錄因子，然后通過分析預測MYB轉錄因子的分子功能。

1.5 ?萼脊蘭MYB轉錄因子表達分析

基于轉錄組數據，獲取萼脊蘭MYB轉錄因子在葉、花蕾和花朵的表達量，采用HemI 1.0.3.7軟件對MYB轉錄因子在各組織表達數據進行分層聚類分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?萼脊蘭MYB家族成員的獲得

從萼脊蘭轉錄組數據庫中共篩選出55條MYB基因序列，片段大小為205～3982 bp。通過ORF預測全長氨基酸序列，發現27條序列具有完整的ORF，片段最短的為499 bp（TRINITY_ DN34588_c1_g2_i3），編碼的154個氨基酸;片段最長的為2461 bp（TRINITY_DN29682_ c0_g1_i1），編碼535個氨基酸。

2.2 ?萼脊蘭MYB轉錄因子基序分析

利用MEME在線軟件分析了27個萼脊蘭MYB轉錄因子家族的10個基序，基序1由50個氨基酸殘基組成，其中包含3個高度保守的色氨

酸（W）殘基，每個色氨酸之間間隔19個氨基酸，屬于R2MYB結構域（圖1C）;基序2由41個氨基酸殘基組成，其中第1個色氨酸被苯丙氨酸（F）所代替，每個色氨酸之間間隔18個氨基酸，其他2個色氨酸殘基高度保守，屬于R3 MYB結構域（圖1D）;萼脊蘭21個轉錄因子包含基序1和基序2，這21條序列均包含R2R3結構域，該結構域是高度保守的，在該區域2（甘氨酸G）、4（色氨酸W）、8～9（谷氨酸E、天冬氨酸D）、12（亮氨酸L）、20（G）和38～44（賴氨酸K、絲氨酸S、半胱氨酸C、精氨酸R、亮氨酸L、精氨酸R、色氨酸W）等30個位點保守不變（圖1）。進一步分析保守的motif序列特征發現，27個MYB轉錄因子均具有典型的HTH結構域。利用分析軟件SMART分析發現，27個蛋白均具有DNA結合區-Myb結構域。

2.3 ?萼脊蘭MYB家族蛋白理化性質分析

萼脊蘭MYB家族蛋白的理化性質分析結果表明（表1），27個MYB家族蛋白的平均相對分子質量為32 651.65，TRINITY_DN67618_c0_g1_i1編碼蛋白的分子質量最小，為17 527.05;TRINITY_ DN29682_c0_g1_i1編碼蛋白的分子質量最大，為58 852.81。等電點（pI）平均值為7.37，TRINITY_ DN43325_c1_g2_i2編碼蛋白的pI最小，為4.67;TRINITY_DN30733_c0_g1_i1編碼蛋白的pI最大，為9.93。其中有13個MYB家族蛋白pI小于7（偏酸性），14個蛋白pI大于7（偏堿性），說明大多數萼脊蘭MYB家族蛋白表現為偏堿性。MYB家族蛋白的平均疏水性值均小于0，說明27個萼脊蘭MYB家族蛋白均屬于疏水蛋白。MYB家族蛋白二級結構特征預測結果顯示，27個萼脊蘭MYB蛋白均具有α螺旋、無規卷曲、延伸鏈和β轉角4種構型，主要由α螺旋和無規卷曲構成（所占比平均值分別為32.28%和54.01%），延伸鏈和β轉角所占比例較小（所占比平均值分別為8.45%和5.25%），TRINITY_DN43325_c1_g2_i2和TRI NITY_DN38485_c0_g4_i2基因編碼蛋白α螺旋所占比例最大，其余25個MYB蛋白均表現為無規卷曲所占比例最大。

2.4 ?萼脊蘭MYB轉錄因子的GO注釋分析

GO注釋分析表明（圖2），萼脊蘭27條MYB轉錄因子序列中分別有22、27、27條被注釋到生物過程、分子功能和細胞組分，所有的序列被進一步富集為27個功能類別，其中DNA結合功能（27個）、細胞核功能（27個）、轉錄作用（24個）、轉錄調節（17個）、轉錄因子活性（13個）、防御響應（9）、茉莉酸響應（6個）、花器官發育（6個）等功能組中包含的序列較多，水楊酸響應（5個）、細胞分化（4個）、鹽脅迫響應（4個）、乙烯響應（4個）、脫落酸響應（4個）、赤霉素調控（3個）、鋅離子結合（2個）、細胞壁生物發生（2個）、缺水響應（2個）、生長素響應（2個）、脫落酸激活信號通路調控（2個）、幾丁質響應（2個）、對鎘離子的響應（2個）、苯丙醇代謝過程的調控（2個）、茉莉酸介導的信號通路的調控（2個）、鋅離子結合（2個）、水楊酸介導的信號通路調控（1個）、花藥壁絨氈層發育（1個）、花粉精細胞分化（1個）等功能組中包含的序列較少。其中生物過程主要富集在細胞合成、生物響應和調控上，分子功能集中富集在結合和轉錄因子活性上，細胞組分主要富集在細胞核部分。綜上所述，萼脊蘭MYB轉錄因子通過結合到DNA區域發揮相應的調控功能，主要涉及植物的細胞過程、發育過程和物質代謝等過程。

2.5 ?萼脊蘭MYB蛋白進化分析

為了研究萼脊蘭MYB蛋白的進化關系并預測其功能，從PlantTFDB數據庫中下載蝴蝶蘭已有的11個MYB家族蛋白氨基酸序列，采用軟件MEGA4構建萼脊蘭MYB家族蛋白和蝴蝶蘭MYB家族蛋白進化樹。由圖3可知，4個萼脊蘭MYB家族蛋白分別與蝴蝶蘭的MYB蛋白聚集在一起，5個蝴蝶蘭的MYB蛋白聚在一起，且比較集中，說明萼脊蘭MYB家族蛋白與蝴蝶蘭MYB蛋白的保守性不是很高。

2.6 ?萼脊蘭次生代謝相關MYB轉錄因子功能分析

通過構建萼脊蘭MYB轉錄因子與蝴蝶蘭所有MYB轉錄因子系統進化樹，篩選同源性較高的蝴蝶蘭MYB轉錄因子，然后分析MYB轉錄因子的分子功能。由表2可知，MYB轉錄因子基因TRINITY_DN38485_c0_g4_i2編碼蛋白同源性較高的蝴蝶蘭轉錄因子PEQU 10866，編碼的蛋白為MYB8，推測其具有調控花色素沉積和參與調節類黃酮的生物合成的功能;TRINITY DN38485_ c0_g1_i1編碼蛋白同源性較高的蝴蝶蘭轉錄因子PEQU 23041，編碼的蛋白為MYB6，推測其可能參與調節類黃酮的生物合成。TRINITY DN40180_ c3_g1_i1編碼蛋白同源性較高的蝴蝶蘭轉錄因子PEQU 05119，編碼的蛋白為MYB10，推測其可能具有協調植物生長發育的功能;TRINITY DN43325 c1 g2 i2編碼蛋白同源性較高的蝴蝶蘭轉錄因子PEQU 30611，編碼的蛋白MYB3，推測其可能具有抑制C4H基因表達的功能。

2.7 ?萼脊蘭MYB轉錄因子基因表達分析

基于萼脊蘭轉錄組數據，獲得萼脊蘭MYB轉錄因子在葉、花蕾、花朵各個組織的基因表達量，并繪制熱圖（圖4）。從圖4可見，MYB轉錄因子在組織表達模式上存在差異，大多數成員在葉、花蕾、花朵中均有表達，表達模式呈現多樣化。萼脊蘭MYB轉錄因子中10個MYB轉錄因子基因在花朵中的表達上調，5個MYB轉錄因子基因在花蕾中表達上調，12個MYB轉錄因子基因在葉片中的表達上調，而萼脊蘭類黃酮的代謝產物主要在花朵和葉片中積累。萼脊蘭MYB 轉錄因子TRINITY_ DN38485_c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1基因均在花朵和葉片中表達量上調，根據表達模式分析：萼脊蘭MYB轉錄因子TRINITY_DN38485_ c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1可能調節類黃酮的生物合成，這也與功能預測一致。

3 ?討論

通過萼脊蘭轉錄組數據分析，共篩選出55條MYB基因序列，片段大小為205～3982 bp。通過ORF預測全長氨基酸序列，發現27條序列具有完整的ORF。GO注釋分析表明，萼脊蘭27條MYB轉錄因子序列中分別有22、27、27條被注釋到生物過程、分子功能和細胞組分。系統進化樹分析發現，萼脊蘭MYB家族蛋白與蝴蝶蘭MYB蛋白的保守性不是很高。

類黃酮廣泛存在于高等植物果實、花瓣和葉片等器官中，萼脊蘭MYB 轉錄因子在組織表達模式上存在差異，在葉片、花蕾和花瓣中均有表達，表達模式呈現多樣化。類黃酮的合成主要包括7個分支：花青素（anthocyanins）途徑、原花青素（proanthocyanidins）途徑、黃酮（flavones）途徑、黃酮醇（flavonols）途徑、異黃酮（isoflavone）和異類黃酮（isoflavonoids）途徑、鞣酐（phlobaphenes）途徑以及橙酮（aurones）途徑[11-12]。預測萼脊蘭MYB轉錄因子TRINITY_DN38485_c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1可能通過黃酮途徑調節類黃酮的生物合成。

除了對MYB蛋白功能的發掘，一些研究者還對其結構進行了深入研究，發現調控類黃酮合成的MYB轉錄因子大部分都是R2R3MYB轉錄因子[13]。蔣卉等[14]研究了蝴蝶蘭響應病毒關鍵MYB家族基因，發現152個MYB家族基因中R2R3型有138個。本研究通過對萼脊蘭蛋白基序分析發現，27個MYB家族基因種21個基因屬于R2R3-MYB類基因，大部分也都是R2R3型轉錄因子，兩者研究結果一致。R2R3-MYB類4個轉錄因子AtMYB3、AtMYB4、AtMYB7和AtMYB32均為類黃酮的生物合成途徑的抑制因子[15-17]。日本龍膽GtMYBP3和GtMYBP4基因在擬南芥中的異源表達激活了內源黃酮醇生物合成基因的表達，導致幼苗中黃酮醇積累增加[18]。在擬南芥中，較早發現并證實的調控類黃酮合成的MYB轉錄因子基因為AtMYB12[19]，同時，在其他物種中也發現了調控類黃酮合成MYB12的同源基因，如番茄SlMYB12[20]、龍膽花GtMYBP3和GtMYBP4[18]。萼脊蘭RINITY_DN38485_c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1同源的蝴蝶蘭MYB 蛋白有MYB7，TRINITY_DN38485_c0_g1同源的蝴蝶蘭MYB蛋白為MYB6和MYB4，同日本龍膽、龍膽、番茄和擬南芥的研究結果一致，說明萼脊蘭的這3個預測的基因與類黃酮的生物合成密切相關。王雪霽等[21]研究發現39個PeMYBs基因在4種器官（根、莖、葉、花）中均表達，48個基因在不同器官中有特異性不表達現象，一些基因呈現器官特異性表達特點，與該研究萼脊蘭MYB轉錄因子在組織表達模式上存在差異，大多數成員在葉、花蕾、花朵中均有表達，表達模式呈現多樣化的結果一致。

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責任編輯：黃東杰

收稿日期 ?2020-05-05;修回日期 ?2020-05-26

基金項目 ?河南省科技廳科技發展計劃項目（No. 172102110227）;河南省科技攻關項目（No. 182102110357）;河南省重大科技專項（No. 701290）。

作者簡介 ?蔣素華（1983—），女，碩士，副教授，研究方向：花卉分子生物學。*通信作者（Corresponding author）：崔 ?波（CUI Bo），E-mail：laocuibo@163.com。