柴葛暢原合劑中葛根素的含量測定

查鑫 阮婧華 范東生 蘇松柏 夏青 辛加敏 湯謹 萬明香

【摘 要】 目的：建立柴葛暢原合劑中葛根素的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為CAPCELL PAK C18色譜柱（4.6mm×250mm，5m） ， 甲醇-0.1%甲酸（30∶[KG-*3/5]70） 為流動相，流速1.0mL/min，波長250nm，柱溫調整到25℃。結果：在這一條件下，葛根素和其他色譜峰分離程度達到要求，在0.0675 ～0.405g質量范圍內線性關系達到要求（r2=0.9999），回收率102.3%，RSD為2.5% （n=6）。結論： 該操作簡單、專屬程度大、靈敏特異性高、重復性強，可以用于該制劑的質量控制。

【關鍵詞】 柴葛暢原合劑; 葛根素;高效液相色譜法

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）1-0034-04

Determination of Puerarin in Chaige Changyuan Mixture

CHA Xin RUAN Jinghua1* FAN Dongsheng SU Songbai XIA Qing XIN Jiamin TANG Jin WANG Mingxiang

The First Affiliated Hospital of Guiyang University of Chinese Medicine， Guiyang 550001， China

Abstract：Objective To establishan a high performance liquid chromatography （HPLC） method for determinationthe content of puerarin in Chaige Changyuan mixture. Methods The chromatographic column was CAPCELL PAK C18 （4.6mm × 250mm， 5 m）. Mobile phase methanol-0.1% formic acid （30∶[KG-*3/5]70）， flow rate 1.0mL·min-1， detection wavelength 250nm， column temperature 25℃. Results Under this condition， the separation degree of puerarin and other chromatographic peaks meets the requirements and peak area was good in 0.0675 ～ 0.405ug （R2=0.9999）， the average recovery was 102.3%， RSD2.5% （n=6）. Conclusion The operation is simple， exclusive， high sensitivity and specificity， and strong repeatability， can be used in the quality control stage of the reagent.

Keywords：Chaige Changyuan Mixture; Puerarin; High Performance Liquid Chromatography

醫院制劑“柴葛暢原合劑”由陶氏柴葛解肌湯合藿香正氣散加減化裁而成[1]，用于感冒風寒、郁而化熱證。處方由葛根、柴胡、穿心蓮等十四味藥組成。葛根為君藥，解肌清熱、生津止渴[2];現代藥理學研究表明葛根主要藥效成分葛根素，具有抗炎、抗氧化等多種功能活性[3-5]，為葛根制劑的主要質量控制指標[6-7]。目前醫院制劑柴葛暢原合劑相關質量標準尚無含量檢測，難以保證該制劑的質量穩定性。本試驗采用HPLC法建立柴葛暢原合劑中葛根素的含量測定方法，以期完善柴葛暢原合劑的質量標準。該操作簡單、專屬性高、靈敏高、重復程度強，能夠應用于該制劑的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（waters E2695，美國waters公司），二極管陣列紫外檢測器（Waters 2998，美國waters公司）;MS105DU天平（梅特勒-托和多儀器有限公司）。

1.2 試藥 柴葛暢原合劑（實驗室自制，批號20200301、20200302和20200303）;葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-201615）;甲醇為色譜純（美國TEDIA公司）;實驗用水是實驗室超濾設備MILLI-Q IQ 7000的過濾水;乙醇為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 CAPCELL PAK C18色譜柱（250mm×4.6mm，5um），流動相A為甲醇，B使用甲酸，其比例為30∶[KG-*3/5]70，溫度控制在25℃，流速需達到1.0mL/min，其波長250nm，體積為10uL。該物質和其他色譜峰分離程度達到需要，時間共需要12min，計算該物質峰理論塔板數不低于4000。

2.2 溶液的制備 對照品溶液設置： 精準稱量對照品5.4mg，采用濃度為30%乙醇進行稀釋定容至20mL容量瓶中，最終濃度為0.27mg/mL。從上述儲備液中取1mL至10mL的量瓶，30%乙醇定容，得濃度 0.027mg/mL對照品溶液，4℃環境中儲存。

供試品溶液制作： 精準吸取供試品1mL至20mL容量瓶中，30%乙醇定容，混勻，過0.22m濾膜，得供試品溶液。

陰性空白對照溶液： 按照相應的比例以及相關的工藝制作陰性該物質樣品，并依照相關的手段制作陰性空白對照。

2.3 專屬性試驗 使用“2.2”中的對照品、供試品和陰性對照溶液，照“2. 1”項下檢測，對其結果進行記錄。結果表明陰性對照不影響該物質的測定。色譜圖如圖 1所示。

2.4 線性關系考察 精密吸取葛根素對照品溶液 2.5L，5L，7.5L，10L，12.5L，15L，按“2. 1”項下色譜條件進行檢測。以檢測物質的進樣量（μg）作為橫軸（X），峰面積為縱軸（Y）制作曲線，得到方程Y=4068.4X-84688（r2=0.9999）。其數據顯示，該物質在0.0675 ～ 0.4050g和峰面積線性關系達到預期。

2.5 精密度試驗 使用“2.4”項下的對照品溶液，依照“2.1”項下色譜環境下，對其進行分析并對其數據處理，重復6次操作，峰面積進行詳細的記錄。結果該物質的峰面積達到RSD為0.52%（n=6），證明儀器的精密程度可以進行試驗。

2.6 穩定性試驗 取供試品溶液（批號202003 01），在0、2、4、8、12、24h，依照“2.1”項下色譜環境下，對其進行分析并對其數據處理，峰面積進行詳細的記錄。結果表明，該物質的峰面積達到RSD為1. 7% （n=6），通過這一結果可以表明溶液在1日內穩定性較好。

2.7 重復性試驗 取相同的6份樣品（ 批號20200301） ，按“2.2”項下制備供試品溶液，依照“2.1”項下色譜環境下進行分析并對其數據處理，檢測其含量。結果表明該物質的平均含量達到0.3217mg/mL，RSD為1.9%（n=6），證實該種方式能夠進行重復測量。

2.8 加樣回收試驗 取已經知道含量的同一批樣品（批號：20200301，樣品中葛根素含量為0.32mg/mL），精準吸取規定體積樣品6份，精準加入質量為0.1601mg葛根素對照品，按“2.2”項下制備相應的供試品溶液，依照“2.1”項下色譜環境下進行分析并對其數據處理，算出回收率。見表1。

2.9 樣品測定 取3批柴葛暢原合劑樣品，按“2.2”項下制作相應的供試品溶液，依照“2.1”項下色譜環境下進行分析并對其數據處理，分別進樣檢測，計算該物質的含量。見表2。

3 討論

3.1 色譜條件優化 柴葛暢原合劑作為本院的院內制劑之一，臨床療效良好、市場需求較大，質量標準低，已不適應中醫藥的現代化，因此本研究參照2015年版《中國藥典》第一部“葛根”項下含量測定方法，采用HPLC色譜法來測定柴葛暢原合劑中葛根素的含量。醫院制劑柴葛暢原合劑的君藥葛根中葛根素的含量測定進行HPLC測定，選擇檢測波長為250nm，嘗試流動相為甲醇-水（25∶[KG-*3/5]75）[8-9]、流速為1.0mL/min等色譜條件，測定柴葛暢原合劑中葛根素的含量，其色譜峰保留時間較長，并沒有達到最佳分離效果。為達到最佳分離效果，相應地調整了色譜條件，流動相選用0.1%甲酸-甲醇（30∶[KG-*3/5]70），流速1.0mL/min，葛根素峰保留時間為12min左右，分離效果好，峰型理想。

3.2 樣品處理優化 試驗中曾用樣品揮干后加30%乙醇定容至20mL加熱回流半小時，過濾，取續濾液作為供試品，結果顯示，其峰面積和筆者所用的樣品處理方法峰面積相差不大，考慮到其簡單，好操作的特點，故筆者采取了“2.1”項下的樣品處理方法，此方法簡便，重復性，專屬性良好，特別適合醫院制劑室利用現有的設備條件進行中藥制劑生產，控制質量。

4 結論

醫院中藥制劑是指市場上不存在但臨床上必需且已獲準生產的制劑類型。它們中的大多數是根據秘密秘方，處方或醫院處方開發的。常用的劑型有合劑，糖漿劑，顆粒劑和膠囊劑等，因為其療效肯定且受患者喜歡。近年來，很多新藥取締了院內制劑，并投入了使用。除此之外，藥品監督管理部門增加了監督管理力度，醫院對中藥制劑的壓力也逐漸增加[10-12]。怎樣提高制劑品質，開發可靠，放心，并且有治療效果的制劑，已成為中醫醫院發展過程中需考慮的關鍵，也是該領域相關人員需解決的任務[13-14]。筆者以醫院制劑柴葛暢原合劑為研究對象，以葛根素做為柴葛暢原合劑中含量測定的指標，建立了高效液相測定其葛根素含量測定的方法。該方法操作簡單、專屬程度大、靈敏特異性高、重復性強，可以在該制劑的質量控制階段使用。

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（收稿日期：2020-07-02 編輯：陶希睿）