TTC法測定金蕎麥種子生活力條件的優化

檀龍顏 吳依琳 馬洪娜

【摘 要】 目的：獲得氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定金蕎麥種子生活力的最佳條件。方法：以染色濃度、染色時間和染色溫度為指標，通過正交試驗、單因素試驗、Central Composite Design響應面分析3種方式進行篩選和優化。結果：TTC濃度0.5 %、染色溫度40℃、染色時間4h為最佳測定條件。結論：用正交試驗、單因素試驗、響應面分析對TTC法測定金蕎麥種子生活力的條件進行篩選和優化是可行的。

【關鍵詞】 金蕎麥;種子生活力;TTC法;正交試驗;單因素試驗;響應面分析

【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）1-0026-05

Optimization of Seed Vigor Test Conditions by TTC Method in Fagopyrum dibotry

TAN Longyan WU Yilin MA Hongna

School of Pharmaceutical Sciences， Guizhou University of Traditional Chinese medicine， Guiyang 550025， China

Abstract：Objective To obtain the best conditions for determination of seed viability of Fagopyrum dibotry by 2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride （TTC） method. Methods The samples with dyeing concentration， dyeing time and dyeing temperature as indexes， and orthogonal test， single factor test and Central Composite Design response surface analysis were used to select and optimize. Results TTC concentration 0.5%， dyeing temperature 40 ℃ and dyeing time 4 h were the best conditions. Conclusion It is feasible to select and optimize the conditions of TTC method to determine Fagopyrum dibotry seed viability by orthogonal test， single factor test and response surface analysis.

Keywords：Fagopyrum Dibotry; Seed Viability; TTC Method; Orthogonal Test; Single Factor Test; Central Composite Design Response Surface Analysis

金蕎麥（Fagopyrum dibotry）為蓼科蕎麥屬（Fagopyrum）多年生草本植物，以干燥根莖入藥[1-2]。現代藥理學[3]研究表明金蕎麥根據具有抗炎鎮痛、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和增強免疫力的作用，在臨床上能夠治療呼吸系統疾病、腸道系統疾病和腫瘤等。同時，金蕎麥種子中富含蛋白質、脂類和維生素等，具有較高的營養價值和保健作用[4]。此外，金蕎麥莖葉為牛羊等牲畜喜食，是一種優良牧草[5]。因此，金蕎麥為一種具有較高經濟價值的資源植物。種子是種子植物的繁殖體，也是植被恢復和重建的物質基礎，而種子的生活力檢測是預判種子是否具有繁殖價值的重要手段[6]。本研究采用正交試驗、單因素試驗和Central Composite Design 響應面試驗對 TTC 法測定金蕎麥種子生活力的條件進行篩選和優化，以期種子為生物學研究和規模化生產提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料 金蕎麥種子采自貴州中醫藥大學藥學院種植資源圃，經貴州中醫藥大學藥學院檀龍顏副教授鑒定為金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）種子，采種后陰干，于4℃保存備用。測定試劑為氯化三苯基四氮唑（TTC） 。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 種子浸泡：將去除雜質，種皮無破損的金蕎麥種子置于燒杯中浸泡24h后，從種子中間切斷，將胚切面較完整的每50個半粒種子置于直徑9cm的培養皿中進行后續實驗。種子染色：方法同馬洪娜等[6]。

1.2.2 正交試驗 選取TTC濃度（A） （0.3%、0.5%、0.7%）、染色溫度（B）（35℃、40℃、45℃）、染色時間（C）（2h、3h、4h）3個因素的不同水平，每組50個半粒種子，通過正交表設計正交試驗。

1.2.3 單因素試驗 ①染色時間試驗：取50個金蕎麥半粒種子，TTC濃度設置為0.5%，溫度設置為40℃，時間設置1h、2h、3h、4h、5h和5個水平;②染色溫度試驗：取50個金蕎麥半粒種子，TTC濃度設置為0.5%，時間設置為4h，溫度設置30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等5個水平;③染色TTC濃度試驗：取50個金蕎麥半粒種子，溫度設置為40℃，時間設置為4h，TTC濃度設置為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%等5個水平。

1.2.4 響應面試驗 以TTC濃度（A）、染色溫度（B）、染色時間（C）為變量，依據Central Composite Design設計原理，設計3因素5水平試驗。每個處理50個金蕎麥半粒種子。以種子生活力為響應值（Y）進行響應面分析。

1.3 數據分析 種子生活力根據染色顏色的深淺和比率計算，利用SPSS17.0軟件和Design Expert 8.0.6軟件進行數據分析，P<0.05表示差異具有統計學意義，P<0.01表示差異具有高度統計學意義，每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果 由表1可知，組合為TTC濃度0.3%，染色溫度35℃，染色時間2h的金蕎麥種子生活力最低（59.3%）， 組合染色溫度40℃，TTC濃度0.5%，染色時間3h種子生活力最高（85.2%）。方差分析結果顯示，因素TTC染色濃度差異顯著，染色溫度和染色時間均差異不顯著（表2）。

2.2 單因素試驗結果 從表3可以看出，隨著染色時間增加，顏色由黃色到粉色再到深紅色，1～ 4h種子生活力逐漸增加，5h時種子生活力顯著降低，種子活力最高為染色4h。因此，金蕎麥種子生活力TTC單因素試驗法的最佳染色時間選擇為4h。

當TTC濃度從0.1 % ～ 0.5 %時，金蕎麥種子的生活力逐漸增大，染色顏色由淺粉色到粉色、紅色，其中TTC濃度為0.5%時最大。當TTC濃度為0.7%時和0.9%時，染色顏色為深紅色，但種子的活力下降下降。因此，金蕎麥種子生活力TTC單因素試驗法的最佳TTC濃度為0.5%（表 4）。

染色溫度為30℃ ～ 40℃之間的金蕎麥種子，種子生活力逐漸增大，胚顏色由淺粉色到淺紅色和紅色。當溫度超過40℃時，種子生活力反而隨著溫度的升高而降低，胚顏色也從黃白色至白色，說明種子并沒有被TTC染色。因此，金蕎麥種子生活力TTC單因素試驗法最佳溫度為40℃（表 5）。

基于以上的3個單因素試驗結果，金蕎麥種子生活力TTC測定法的單因素試驗中，TTC濃度（0.5%）×染色溫度（40℃）×染色時間（4h）為最佳條件，該結果與正交試驗結果相近。

2.3 響應面優化

2.3.1 模型的建立與分析 根據Central Composite Design試驗設計及結果分析見表6，將表6結果數據進行多元回歸分析，分析結果見表7。回歸分析得回歸方程：Y=+86.79+0.35A-3.04B+1.96C-6.96AB-0.46AC-3.39BC-10.36A2-5.64B2-2.44C2。模型的F值為16.37，且P<0.0001，表明模型差異極顯著。校正決定系數R2adj=0.9848，相關系數R2=0.9424，表明該模型的擬合度較好，可用于種子生活力的理論預測。模型的變異系數為5.45%（<10%），表明模型穩定性良好，試驗操作可靠。模型的信噪比為10.315（>4），表明該模型能真實地反映試驗結果。

模型系數的顯著性檢驗表明，3個因素對金蕎麥種子生活力測定影響差異極顯著，且各因素的影響順序為染色溫度>染色時間>TTC濃度。

2.3.2 響應面分析 響應面試驗法中，響應面圖曲面坡度的陡峭程度，能直觀體現各兩個因素的交互作用對種子生活力響應值的影響。其中，染色溫度與TTC濃度的交互作用對響應值影響最大（圖1），響應面的傾斜度最高，其次是TTC濃度與染色時間（圖2），最后是染色溫度與染色時間（圖3）。通過響應面法優化，試驗組TTC濃度（0.5%）×染色溫度（40℃）×染色時間（4 h）是金蕎麥種子生活力TTC法測定的最佳條件，此組合下，理論種子生活力為87.8%。在此條件下，進行驗證，重復3次，實測生活力為86.72%、86.93%、86.7%，平均生活力為86.78%。試驗生活力測定值與理論預測值的誤差為1.02%（<5%），因此，應用Design-Expert中的Central Composite Design響應面設計優化金蕎麥種子TTC法測定條件是可行的。

3 討論

3.1 利用響應面優化能得到較為精確的試驗參數 盡管正交試驗能夠減少工作量，且具有高效、快速和經濟等優勢，但是正交試驗的優選結果不會超越所取水平的范圍，不是很精確。單因素講究效率，但是篩選的參數范圍不是很精確。因此，無論是單因素試驗還是正交試驗都有一定的缺限。而本試驗種響應面分析優化金蕎麥種子生活力測定的最佳條件為TTC濃度（0.5 %）×染色溫度（40℃）× 染色時間（4h），與正交試驗和單因素試驗的結果相近或一致。表明單因素試驗與正交試驗結合，同時利用響應面法優化，則能得到較為可靠的試驗參數。

3.2 響應面分析法能在更廣闊的領域應用 響應面分析法利用合理的試驗設計方法并通過實驗得到一定數據，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題，一般在工程類工藝設計中應用較為廣泛。農業生產方面，頭花蓼種子[7]和羊耳菊種子[8]，以及山豆根種子[6， 9]生活力測定中，通過響應面分析優化相應測定條件已獲得了較好的結論，且本文結果也表明利用響應面分析優化金蕎麥種子生活力測定條件是可行的。因此，響應面分析法的應用面較廣，可在農業生產領域應用。

參考文獻

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志（第25卷，第一分冊）[M]. 北京： 科學出版社， 1985 ： 111-112.

[2]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. 一部. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2015 ： 218.

[3]嚴晶， 袁嘉嘉， 劉麗娜， 等. 金蕎麥藥理作用及臨床應用研究進展[J]. 山東中醫雜志， 2017， 36（7） ： 621-624.

[4]吳清， 梁國魯. 金蕎麥野生資源的開發與利用. 中國野生植物資源[J]， 2001， 20（2） ： 27-28.

[5]趙麗麗， 王普昶， 陳超， 等.持續干旱對金蕎麥生長、生理生態特性的影響及抗旱性評價[J]. 草地學報， 2016， 24（4） ： 825-833.

[6]馬洪娜， 吳依琳， 何 雨， 等. TTC 法測定山豆根種子生活力條件的優化[J]. 種子， 2019， 38（9） ： 43-47.

[7]王志威， 魏升華， 李俊， 等. 頭花蓼種子生活力TTC法最優測定條件研究[J]. 南方農業， 2018， 12（25） ： 1-6.

[8]成小璐， 魏怡冰， 魏升華， 等. 羊耳菊種子生活力的最佳測定條件[J]. 貴州農業科學， 2016， 44（8） ：100-104.

[9]檀龍顏， 吳月君， 何雨. 溴麝香草酚藍法測定山豆根種子生活力的條件優化研究[J]. 現代農業科技， 2020，（6） ： 74-75，79.

（收稿日期：2020-07-03 編輯：陶希睿）