孤獨(dú)癥譜系障礙小鼠模型行為學(xué)檢測(cè)方法

王劍飛，韓俊海，張子超

孤獨(dú)癥譜系障礙小鼠模型行為學(xué)檢測(cè)方法

王劍飛，韓俊海，張子超

東南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，發(fā)育與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210096

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)是一種遺傳相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性疾病，患者主要呈現(xiàn)社交缺陷、溝通障礙、重復(fù)刻板行為和學(xué)習(xí)記憶障礙等核心癥狀。小鼠模型是探究孤獨(dú)癥譜系障礙的致病機(jī)理和尋找潛在治療方法的重要工具，而小鼠行為學(xué)的觀測(cè)和分析可以幫助人們更好地了解不同遺傳操作對(duì)相應(yīng)孤獨(dú)癥表型的影響，從而闡釋疾病機(jī)理。本文列舉了針對(duì)孤獨(dú)癥患者核心缺陷的相關(guān)小鼠行為學(xué)分析方法，包括檢測(cè)社交缺陷的三廂社交實(shí)驗(yàn)、居住者–入侵者實(shí)驗(yàn)、筑巢實(shí)驗(yàn)和超聲波檢測(cè)；檢測(cè)重復(fù)刻板行為的Y迷宮自主選擇實(shí)驗(yàn)、捋毛實(shí)驗(yàn)、刻板行為分析實(shí)驗(yàn)和彈珠埋藏實(shí)驗(yàn)；檢測(cè)焦慮行為的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和明暗穿梭實(shí)驗(yàn)；檢測(cè)學(xué)習(xí)和記憶障礙的新事物選擇實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)。本文詳細(xì)描述了這些行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程、注意事項(xiàng)以及規(guī)范的數(shù)據(jù)分析方法，可以幫助研究人員進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。同時(shí)本文對(duì)已知孤獨(dú)癥小鼠遺傳模型中的各項(xiàng)行為學(xué)表型進(jìn)行了匯總和比較，為相關(guān)研究人員提供系統(tǒng)參照。

孤獨(dú)癥譜系障礙；小鼠行為學(xué)分析；社交障礙；重復(fù)刻板；學(xué)習(xí)記憶；焦慮

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)是一類發(fā)病率達(dá)1%[1]的高發(fā)兒童神經(jīng)發(fā)育障礙疾病，近年來呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，因其對(duì)家庭和社會(huì)生活的影響而引起了廣泛關(guān)注。絕大多數(shù)孤獨(dú)癥患者具有典型的語(yǔ)言障礙以及重復(fù)刻板行為，運(yùn)動(dòng)機(jī)能低下并常伴隨有嚴(yán)重的肌肉緊張癥，在學(xué)習(xí)、交流和生活方面存在諸多障礙。此外，大部分患者會(huì)有各種并發(fā)疾病，包括智力障礙(約45%)、兒童注意力缺陷多動(dòng)癥(28%~44%)、抽搐性運(yùn)動(dòng)障礙(14%~38%)、胃腸性問題(9%~70%)、免疫失調(diào)(<38%)、焦慮(42%~56%)、沮喪(12%~70%)、強(qiáng)迫癥狀(19%~32%)，以及自殘行為(<50%)等[2]。

ASD的致病機(jī)理復(fù)雜，涉及遺傳和環(huán)境因素等多方面因素。約有25%的患者是由遺傳原因?qū)е耓3]，目前研究已發(fā)現(xiàn)了超過102個(gè)孤獨(dú)癥相關(guān)基因[4]。除此以外，由于暴露在重金屬、阻燃劑、殺蟲劑、用于乙烯基和化妝品的鄰苯二甲酸鹽、以及細(xì)菌或病毒感染等環(huán)境也會(huì)導(dǎo)致ASD[5]。為了探究ASD的致病機(jī)理和尋找潛在的治療方法，研究者們已經(jīng)建立起了多種小鼠模型：(1)通過特定藥物誘發(fā)產(chǎn)生ASD模型，如丙酸(PPA)模型和丙戊酸(VPA)模型；(2)直接利用行為學(xué)方法等篩選出既有典型ASD癥狀，如近交系 BTBR-T+tf/J和BALB/cByJ小鼠模型；(3)最重要的是利用基因改造獲得的大量ASD模型，如基因敲除/敲入、和的基因敲除模型等[6]。這些基因工程小鼠模型在國(guó)內(nèi)可以從上海南方模式動(dòng)物中心和集萃藥康等平臺(tái)獲取，科研人員可以從整體水平研究基因或者生化因素在ASD病理中的作用，從分子、細(xì)胞、組織和行為學(xué)不同層次進(jìn)行分析，觀察干預(yù)療效，這對(duì)于闡釋疾病機(jī)理和研究治療方法至關(guān)重要。

本文匯總了針對(duì)社交行為、重復(fù)刻板行為、焦慮和學(xué)習(xí)記憶等研究常用的小鼠行為學(xué)分析方法，詳細(xì)介紹了各種方法的實(shí)驗(yàn)原理、裝置、操作以及數(shù)據(jù)記錄分析等內(nèi)容，并總結(jié)了已知孤獨(dú)癥基因工程小鼠模型中的相關(guān)行為學(xué)表型，希望為擬開展相關(guān)ASD研究人員提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施的具體參考。

1 材料和方法

1.1 小鼠及飼養(yǎng)條件

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中大多采用3~4月齡(誘導(dǎo)分離超聲波檢測(cè)為出生后的幼崽)的雄性同窩小鼠，之前沒有進(jìn)行過任何行為測(cè)試。小鼠均在SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)于購(gòu)自蘇州楓橋凈化公司的普通飼養(yǎng)籠，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)需在安靜的恒溫封閉房間進(jìn)行，行為測(cè)定要在光周期內(nèi)完成。行為測(cè)試裝置包括各種行為箱及配套設(shè)備和視頻分析系統(tǒng)(SuperMaze)等可以從上海欣軟公司購(gòu)買。

1.2 三廂社交實(shí)驗(yàn)

三廂社交實(shí)驗(yàn)(three-chamber social test)：2004年Crawley等[7]根據(jù)小鼠的群居性和社會(huì)性以及形成一定社交記憶的原理，開發(fā)出自動(dòng)化的三廂社交實(shí)驗(yàn)，可以直接自動(dòng)化的測(cè)量小鼠社交行為，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和高通量的分析。三廂社交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是正常小鼠具有社交能力，當(dāng)面對(duì)同類時(shí)，會(huì)更愿意和同類小鼠接觸，而不是單處一室；當(dāng)出現(xiàn)陌生的同類時(shí)，正常小鼠能把它和熟悉的同伴區(qū)分開來，更多的和陌生個(gè)體接觸，表現(xiàn)出社交新穎性。

三廂社交行為箱整體為敞口的長(zhǎng)方體，中間被兩塊醫(yī)用有機(jī)擋板均分為3個(gè)獨(dú)立小室，每個(gè)擋板下方均有一個(gè)可控制開關(guān)的小門方便小鼠自由進(jìn)出各室。左右兩室的角落各有一個(gè)鐵質(zhì)的網(wǎng)格狀束縛器，束縛放入其中的小鼠。實(shí)驗(yàn)前兩天，將待測(cè)小鼠放入行為房飼養(yǎng)使小鼠熟悉測(cè)試環(huán)境，減少小鼠因環(huán)境差異而造成的實(shí)驗(yàn)誤差；實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常在較暗的環(huán)境中進(jìn)行，行為箱內(nèi)光照可以維持在40 lux，溫度保持在24℃，實(shí)驗(yàn)人員避免出現(xiàn)在小鼠的視線之內(nèi)，并減少噪音的產(chǎn)生，維持環(huán)境音量在30 dB以下，保持安靜；每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束用70%酒精去除行為箱內(nèi)氣味和異物，并用衛(wèi)生紙擦拭干凈。

實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)階段：(1)適應(yīng)階段：將實(shí)驗(yàn)小鼠背朝實(shí)驗(yàn)者放入行為箱的中央室，打開左右擋板的小門使其自由活動(dòng)10 min，充分熟悉環(huán)境；(2)社交能力檢測(cè)：10 min后將小鼠重新放至中央室，關(guān)閉左右擋板的小門并在左右兩室的束縛器中隨機(jī)放入一只同種相似年齡段的小鼠(stranger 1)，另一個(gè)保持空置(empty)，打開左右擋板的小門使其自由活動(dòng)10 min并記錄；(3)社交新穎性檢測(cè)：10 min后將小鼠重新放至中央室，關(guān)閉左右擋板的小門，取出stranger 1再次隨機(jī)放入到任一束縛器中，然后在另一束縛器中放入另一只同種相似年齡段的小鼠(stranger 2)，打開左右擋板的小門使其自由活動(dòng)10 min (圖1)并記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束將小鼠放回飼養(yǎng)籠，清洗行為箱，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3 居住者–入侵者實(shí)驗(yàn)

居住者–入侵者實(shí)驗(yàn)(resident-intruder test)：同一物種成員之間的社會(huì)沖突來產(chǎn)生情感和心理壓力，讓失敗者產(chǎn)生社交挫敗，失敗者會(huì)有生理和行為變化[8]。小鼠天生具有領(lǐng)地意識(shí)會(huì)攻擊外來侵入者，研究人員發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)中居住者的攻擊性行為和非攻擊性的社交行為可以模擬孤獨(dú)癥患者的暴力傾向和社交缺陷。

實(shí)驗(yàn)使用常規(guī)的透明飼養(yǎng)籠(30 cm×17 cm× 16 cm)即可檢測(cè)小鼠的社交行為。實(shí)驗(yàn)環(huán)境與三廂社交實(shí)驗(yàn)相同，實(shí)驗(yàn)通常分為兩個(gè)階段：(1)實(shí)驗(yàn)前將待測(cè)鼠(居住者)和標(biāo)準(zhǔn)的非進(jìn)攻鼠(入侵者：年齡相仿，體型和體重與待測(cè)小鼠相仿或略低)單獨(dú)飼養(yǎng)一周，培養(yǎng)它們的領(lǐng)地意識(shí)。為了增強(qiáng)領(lǐng)地意識(shí)，也可以引進(jìn)同窩雌鼠共同飼養(yǎng)；(2)實(shí)驗(yàn)時(shí)保持待測(cè)小鼠籠內(nèi)環(huán)境不變(若有雌鼠則在實(shí)驗(yàn)前24 h取出)，將標(biāo)準(zhǔn)的非進(jìn)攻鼠作為入侵者放入，記錄并統(tǒng)計(jì)10 min內(nèi)小鼠的行為表現(xiàn)(圖2A)并記錄。實(shí)驗(yàn)連續(xù)4 d，每天選取同一時(shí)間實(shí)驗(yàn)、記錄和觀察。

圖1 三廂社交實(shí)驗(yàn)

1.4 筑巢實(shí)驗(yàn)

筑巢實(shí)驗(yàn)(nesting test)：群居小鼠通過筑巢來保溫和防御，其筑巢能力與母性行為、家庭社交行為和繁殖等因素有關(guān)，具有社會(huì)交流的性質(zhì)。2006年Deacon等[9,10]在初級(jí)巢穴評(píng)級(jí)基礎(chǔ)上(0：沒有巢；1：平巢；2：巢蓋住小鼠)制定了更加精細(xì)的5分巢穴評(píng)分表，廣泛應(yīng)用于小鼠社交行為檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)在常規(guī)飼養(yǎng)條件下的透明飼養(yǎng)籠(30 cm× 17 cm×16 cm)中即可檢測(cè)小鼠的社交行為。在正常的光周期(時(shí)間為7: 00~19: 00光照，19: 00~7: 00黑暗)和溫濕度(溫度保持在26℃，濕度保持在40%~70%)的飼養(yǎng)房中，下午6時(shí)將一定量的筑巢材料(片狀、屑狀、條狀的木質(zhì)和紙質(zhì)材料最佳，避免使用棉質(zhì)材料，防止纖維狀的棉絮阻礙小鼠行動(dòng)和損傷小鼠眼睛[11])放入鼠籠，并給予充足的食物與水。第二天早上7點(diǎn)觀察筑巢結(jié)果，小鼠筑巢過程中避免實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)出鼠房，保持安靜的環(huán)境，避免打擾小鼠筑巢。

1.5 超聲波發(fā)聲檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

超聲波發(fā)聲(ultrasonic vocalizations, USVs)：USVs被小鼠用來傳遞情緒狀態(tài)相關(guān)信息進(jìn)行互動(dòng)和交流，與小鼠社會(huì)行為密切相關(guān)。目前3種類型的USVs在實(shí)驗(yàn)室小鼠中得到了大量研究：幼崽隔離誘導(dǎo)產(chǎn)生的USVs、青年小鼠社會(huì)交流產(chǎn)生的USVs和成年小鼠社交互作產(chǎn)生的USVs。Premoli等[12]歸納描述了小鼠幼崽與母親分離時(shí)發(fā)出的USVs并認(rèn)為其促進(jìn)了母親和子女之間的社會(huì)交流；Panskepp等[13]發(fā)現(xiàn)USVs在青年小鼠中與社會(huì)互作和運(yùn)動(dòng)水平相關(guān)；Egnor等[14]認(rèn)為成年小鼠求偶和交配時(shí)產(chǎn)生的USVs在社會(huì)、性行為中具有重要作用。

圖2 居住者–入侵者實(shí)驗(yàn)

A：實(shí)驗(yàn)設(shè)置示意圖；B：小鼠攻擊性行為(上)和非攻擊性社交(下)示例。

隔離誘導(dǎo)USVs是幼崽在與母親分離時(shí)發(fā)出的求救叫聲，代表著幼崽與母親之間的聲音交流行為，這種行為被認(rèn)為與ASD有關(guān)，在ASD小鼠模型中幼崽表現(xiàn)出USVs釋放受損或呼叫模式異常。

實(shí)驗(yàn)采用SONOTRACK超聲波監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，其主要由測(cè)量箱和控制器兩部分組成。測(cè)量箱可充分隔音且內(nèi)層有專用隔音棉減少回聲，箱內(nèi)空間可以放置標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼養(yǎng)籠。每個(gè)測(cè)試箱內(nèi)還包含有易安裝且能夠收集全段超聲信號(hào)的敏度麥克風(fēng)、超低噪音放大器、整套LED照明設(shè)備和低噪音通風(fēng)設(shè)備。控制器控制整個(gè)測(cè)量箱照明、通風(fēng)以及進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄，并與系統(tǒng)相連進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

實(shí)驗(yàn)前，保持幼崽和母鼠的生活環(huán)境不變。實(shí)驗(yàn)時(shí)在出生后的2、4、6、8、12日將幼崽從母鼠身邊分離，放置在測(cè)量箱內(nèi)一個(gè)直徑5 cm、高度10 cm的空塑料容器中；測(cè)量幼崽的體溫，并保持測(cè)量箱內(nèi)溫度恒定為21℃；將麥克風(fēng)通過測(cè)量箱蓋中的小孔固定安裝，離幼崽上方約20 cm，記錄并統(tǒng)計(jì)5 min內(nèi)幼崽發(fā)出的USVs；錄音結(jié)束后，再次測(cè)量幼崽的體溫，實(shí)驗(yàn)前后應(yīng)保持幼崽體溫一致，避免因寒冷導(dǎo)致記錄的USVs差異；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后利用70%的酒精擦洗測(cè)量箱，并開始下一組實(shí)驗(yàn)[15]。

求偶則是成年小鼠社交互動(dòng)的一種表現(xiàn)形式，雄鼠在面對(duì)成年雌鼠或其氣味時(shí)會(huì)釋放大量的USVs，吸引雌鼠注意并增加求偶的成功率[16]。社交缺陷會(huì)影響雄鼠在求偶過程中的USVs釋放，在ASD小鼠模型中，雄鼠會(huì)表現(xiàn)出USVs釋放受損或呼叫模式異常。

實(shí)驗(yàn)同樣采用SONOTRACK超聲波監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)前將待測(cè)的雄鼠在單獨(dú)的飼養(yǎng)籠中隔離飼養(yǎng)5 d，并將其放置在行為房熟悉環(huán)境；實(shí)驗(yàn)當(dāng)天檢查相同基因型的陌生雌鼠的陰道，選取發(fā)情期的雌鼠為引入對(duì)象；實(shí)驗(yàn)時(shí)將飼養(yǎng)籠放置入測(cè)量箱，固定麥克風(fēng)距雄鼠上方約20 cm，然后將發(fā)情的雌鼠引入被隔離的雄鼠飼養(yǎng)籠，記錄并統(tǒng)計(jì)5 min內(nèi)雄鼠發(fā)出的USVs；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后利用70%的酒精擦洗測(cè)量箱，并開始下一組實(shí)驗(yàn)。

1.6 Y-迷宮自發(fā)選擇實(shí)驗(yàn)

Y-迷宮自主選擇實(shí)驗(yàn)(Y maze spontaneous selec-tion test)：依據(jù)小鼠具有探索新環(huán)境的天性，1976年Olten等[17]開發(fā)了Y迷宮用于測(cè)量大鼠的特殊學(xué)習(xí)和記憶能力。在ASD模型中，小鼠如果認(rèn)定環(huán)境和事物后很難做出改變就被認(rèn)為具有重復(fù)刻板的偏執(zhí)性行為[18]。

Y-迷宮由3條等長(zhǎng)的支臂(35 cm×5 cm×15 cm)和一個(gè)連接區(qū)組成，每?jī)蓷l臂之間的夾角均為120°，3條臂交匯處的連接區(qū)有可供打開的小門，方便小鼠自由進(jìn)出。

實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)環(huán)境與三廂社交實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)：(1)先任選一條臂作為起始臂，將小鼠背對(duì)實(shí)驗(yàn)者面向迷宮中心輕輕放入，打開門，當(dāng)小鼠選擇進(jìn)入一條臂的時(shí)候，關(guān)閉門，使小鼠在其中自由活動(dòng)5 min，并將小鼠進(jìn)入的臂記作目標(biāo)臂，另一條臂記作非目標(biāo)臂[19]；(2)將小鼠重新放入起始臂，打開門，記錄小鼠進(jìn)入的臂；(3)重復(fù)(2)中操作20次，記錄并統(tǒng)計(jì)小鼠進(jìn)入目標(biāo)臂和非目標(biāo)臂的次數(shù)(圖3)。

1.7 捋毛實(shí)驗(yàn)

捋毛實(shí)驗(yàn) (grooming)：小鼠具有梳理毛發(fā)的天性，在梳理行為中，Berridge和Bursten等[20,21]首先揭示了小鼠復(fù)雜的固定梳理動(dòng)作模式，并在一種松鼠()中，將其儀式化為一種刻板的展示，隨后梳理毛發(fā)作為反應(yīng)重復(fù)刻板行為的指標(biāo)廣泛適用于孤獨(dú)癥小鼠模型中。常見的捋毛動(dòng)作包括前肢梳理、摩擦清洗顏面、身體腹側(cè)、尾部和生殖器清理(圖4，A~C)等。

圖3 Y-迷宮自主選擇實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)使用常規(guī)的飼養(yǎng)籠即可檢測(cè)小鼠的重復(fù)刻板行為。實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)環(huán)境與三廂社交實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠置于30×17×16 cm干凈透明的飼養(yǎng)籠中，給與充足的食物和水讓其自由探索10 min；10 min后打開攝像頭，記錄30 min內(nèi)小鼠在籠子里自由活動(dòng)數(shù)據(jù)。每次試驗(yàn)之間，用70%的乙醇清洗開闊的場(chǎng)地。

1.8 其他刻板行為分析實(shí)驗(yàn)

刻板行為分析(stereotyped behavior analysis test)：刻板行為被認(rèn)為是孤獨(dú)癥譜系障礙的核心癥狀之一。具體的刻板行為表征最早是從Kanner[22]描述的11名兒童開始為人所知，而在ASD小鼠模型中也觀察到一系列刻板行為檢測(cè)，包括高水平的轉(zhuǎn)圈、空翻、后肢站立、垂直跳躍、重復(fù)的前肢運(yùn)動(dòng)、咀嚼墊料或無意義咀嚼、搖頭和嗅探同一位置等[23]。

實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)環(huán)境與三廂社交實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠置于30 cm×17 cm×16 cm干凈透明的飼養(yǎng)籠中，鋪上墊料并給與充足的食物和水讓其自由探索10 min；10 min后打開攝像頭，記錄30 min內(nèi)小鼠在籠子里自由活動(dòng)數(shù)據(jù)。每次試驗(yàn)之間，用70%的乙醇清洗開闊的場(chǎng)地。

1.9 彈珠埋藏實(shí)驗(yàn)

彈珠埋藏實(shí)驗(yàn)(marble-burying tests)：挖掘和掩埋是小鼠的一種典型行為，實(shí)驗(yàn)最初用于評(píng)估嚙齒類動(dòng)物的焦慮行為，但2009年Thomas等[24,25]更偏向于其為測(cè)量重復(fù)性或強(qiáng)迫性挖掘行為的測(cè)試，并可以定量地檢測(cè)ASD小鼠模型中重復(fù)刻板行為。

實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)環(huán)境與三廂社交實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)將新鮮無味的墊料加入到嶄新的飼養(yǎng)籠中(30 cm×17 cm×16 cm)，深度為5 cm，并將墊料壓平壓實(shí)；將標(biāo)準(zhǔn)玻璃彈珠(各種款式和顏色，直徑約為2 cm，重量約為5 g)，按5排每排4彈珠等距離地輕放在墊料上(圖5)；打開攝像頭，記錄30 min內(nèi)小鼠的運(yùn)動(dòng)情況。每次實(shí)驗(yàn)之間，更換鼠籠和墊料，并用溫和的洗滌劑清洗彈珠，蒸餾水徹底沖洗，使用前晾干。

1.10 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test)：將動(dòng)物置于一個(gè)被周圍墻壁阻止逃跑的未知環(huán)境，是一種被廣泛應(yīng)用的類焦慮行為模型，起初為了評(píng)估動(dòng)物情緒而開發(fā)，隨后也被Archer等[26,27]用于檢測(cè)動(dòng)物的行為運(yùn)動(dòng)能力。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，小鼠具有畏懼空曠場(chǎng)地而進(jìn)行躲避的天性，而另一方面又會(huì)對(duì)空曠中心產(chǎn)生探究的好奇心理，兩者沖突從而引發(fā)焦慮。

實(shí)驗(yàn)使用曠場(chǎng)行為箱檢測(cè)小鼠自發(fā)活動(dòng)行為，探索行為和焦慮。行為箱整體為40 cm×40 cm×40 cm敞口的正方體，實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)環(huán)境與三廂社交實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠背朝實(shí)驗(yàn)人員放入行為箱(圖6A)的正中心，讓其自由探索10 min；10 min后打開攝像頭，記錄10 min內(nèi)小鼠在行為箱內(nèi)自由活動(dòng)數(shù)據(jù)(圖6B)，每次試驗(yàn)之間，用70%的乙醇清洗行為箱。

圖4 小鼠捋毛行為

A：清洗顏面；B：清理前肢；C：尾部清理。

圖5 彈珠埋藏實(shí)驗(yàn)

圖6 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

A：行為箱；B：行為箱俯視觀測(cè)圖(中間藍(lán)色圓圈是人為劃定的中央?yún)^(qū)，紅色曲線為小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡)。

1.11 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(the elevated plus maze test)：小鼠具有恐高的天性，對(duì)高處天然趨避，但對(duì)新環(huán)境又有探索的好奇心。1958年Montgomery等發(fā)現(xiàn)暴露在高架的迷宮通道中所引發(fā)的這種探究–趨避沖突，比暴露在封閉的曠場(chǎng)中所引發(fā)的焦慮沖突要強(qiáng)烈得多，基于此設(shè)計(jì)出開放和封閉區(qū)域不均一的高架Y-迷宮實(shí)驗(yàn)；1985年P(guān)ellow等[28]利用等長(zhǎng)的開放和封閉臂優(yōu)化成高架十字迷宮檢測(cè)小鼠的焦慮行為。

整個(gè)高架十字迷宮由兩條等長(zhǎng)的臂(35 cm× 5 cm)十字交叉組成，其中一條臂的四周有不透明的擋板圍住，稱為閉臂(35 cm×5 cm×15 cm)；另一條周圍無擋板的臂稱為開臂；兩臂交叉的無擋板部分稱為中央?yún)^(qū)(5 cm×5 cm)。整個(gè)迷宮離地約60 cm，給小鼠營(yíng)造一個(gè)恐懼的環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)環(huán)境與三廂社交實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠背朝實(shí)驗(yàn)者，面向開臂放在高架十字迷宮(圖7)的中央?yún)^(qū)，用攝像頭記錄小鼠5 min內(nèi)的行為數(shù)據(jù)，然后將小鼠取回放入飼養(yǎng)籠，更換實(shí)驗(yàn)小鼠，面向同一開臂放入迷宮。每次試驗(yàn)之間，用70%的乙醇清洗迷宮，若小鼠在迷宮中長(zhǎng)時(shí)間無運(yùn)動(dòng)或從迷宮墜落，則不計(jì)入最后的分析。

1.12 明暗穿梭實(shí)驗(yàn)

明暗穿梭實(shí)驗(yàn)(light/dark transition test)：基于小鼠對(duì)明亮照明區(qū)域的自然厭惡，以及對(duì)新環(huán)境的自發(fā)探索行為，2006年Takao[29]等利用人為控制的明暗環(huán)境優(yōu)化設(shè)計(jì)出明暗穿梭實(shí)驗(yàn)，用于檢測(cè)小鼠的類焦慮行為。

明暗行為箱(27cm×27 cm×45 cm)由大小相同的明箱和暗箱組成，箱體頂部加蓋，內(nèi)部固定有高清攝像機(jī)記錄小鼠活動(dòng)數(shù)據(jù)，明箱內(nèi)有亮光照明，兩箱之間的隔墻有一個(gè)可控制的門洞(7.5 cm×7.5 cm)供小鼠穿梭。

實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)環(huán)境與三廂社交實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)首先打開明暗箱內(nèi)的發(fā)光二極管，明箱中由白色二極管(390 Lux)明亮地照亮，而暗箱中則是黑色二極管(2 Lux)照射；將小鼠置于暗箱中，當(dāng)紅外攝像頭檢測(cè)到小鼠3 s后控制開門(防止小鼠在釋放后立即進(jìn)入光室，并有逃離實(shí)驗(yàn)的動(dòng)機(jī))；記錄10 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)情況，并在下一組實(shí)驗(yàn)前用70%的乙醇清洗行為箱。

1.13 新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)

新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)(novel-object recognition test)：1988年由Enaceur和Delacour等[30]引入，目的是評(píng)估大鼠在熟悉環(huán)境中識(shí)別新物體的能力。從那時(shí)起，這項(xiàng)測(cè)試就開始流行起來，用于測(cè)試嚙齒類動(dòng)物的認(rèn)知記憶。小鼠先天對(duì)新物體有探索傾向并通過對(duì)新物體(形狀、大小等)的靈活變換可檢測(cè)小鼠短期記憶和認(rèn)知能力。

圖7 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

新事物識(shí)別行為箱為上方敞口、四周透明的40 cm×40 cm×40 cm正方體，也可用曠場(chǎng)行為箱替代。實(shí)驗(yàn)前五天，每天撫摸實(shí)驗(yàn)小鼠1 min，避免刺激小鼠，使其消除與測(cè)試者的陌生感，實(shí)驗(yàn)前兩天將小鼠放入行為房熟悉環(huán)境。實(shí)驗(yàn)環(huán)境與三廂社交實(shí)驗(yàn)相同，實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)階段：(1)將小鼠放入行為箱自由活動(dòng)5 min，然后將小鼠移出行為箱并在行為箱側(cè)壁7 cm左右的位置水平放置兩個(gè)形狀、大小以及顏色均相同的物體(直徑約3 cm)；(2)將小鼠背對(duì)物體重新放入行為箱中央后打開攝像頭記錄其10 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)(圖 8A)；(3)將小鼠放回飼養(yǎng)籠，并將行為箱內(nèi)一個(gè)物體隨機(jī)替換為另一個(gè)大小相似但形狀和顏色不同的新物體，1 h后將小鼠重新背對(duì)物品放入行為箱記錄10 min的活動(dòng)(圖 8B)。

1.14 水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris water maze test)：小鼠天生厭水，在水中會(huì)選擇最佳的路線逃離水環(huán)境。根據(jù)此特性1981年Morris通過強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳設(shè)計(jì)出水迷宮實(shí)驗(yàn)，并迅速成為評(píng)估空間記憶和空間導(dǎo)航的標(biāo)準(zhǔn)任務(wù)。通過觀測(cè)小鼠在逃亡過程中是否能利用周圍環(huán)境進(jìn)行定位尋找隱藏在水中的逃生平臺(tái)來檢驗(yàn)小鼠的空間參考記憶能力。小鼠搜尋并登上平臺(tái)所用的時(shí)間越短，小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力也就越強(qiáng)[31]。

圖8 新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)

A：事物認(rèn)知；B：新事物識(shí)別。

水迷宮行為箱整體為直徑110 cm、高95 cm敞口的圓柱體，通過在地上劃線將箱內(nèi)人為等分為4個(gè)區(qū)域(Q1~Q4)，并在Q2內(nèi)通過支架固定一個(gè)直徑約8 cm的逃生平臺(tái)，每個(gè)區(qū)域箱壁等高的位置固定1個(gè)形狀不同的標(biāo)記物(高逃生平臺(tái)約20 cm，如三角形、圓形、正方形和五角星等)，作為逃生平臺(tái)的空間參考，并在正下方設(shè)置人為的入水口，將小鼠放入行為箱中。

小鼠放在行為房中飼養(yǎng)兩天，使其熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)前先灌水入迷宮中，直到其剛淹沒逃生平臺(tái)為止，同時(shí)保持室溫和水溫在24℃左右，并根據(jù)小鼠體色選擇高對(duì)比度的試劑將水變渾濁(如棕色或黑色鼠可用牛奶)，一方面阻擋小鼠的視線，隱藏水下的逃生平臺(tái)，另一方面確保SuperMaze系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確捕捉到小鼠的蹤跡(圖9A)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)為3個(gè)階段：(1)記憶獲取。將小鼠以半隨機(jī)方式選擇入水口，背對(duì)實(shí)驗(yàn)人員面朝池壁放入迷宮中，記錄小鼠60 s內(nèi)在迷宮內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況。若小鼠在60 s內(nèi)搜尋并登上平臺(tái)，讓其在平臺(tái)停留30 s以便根據(jù)4個(gè)入水口上的固定參照物對(duì)平臺(tái)位置進(jìn)行空間學(xué)習(xí)和記憶(圖9B)，并判定小鼠逃亡成功；若小鼠在60 s內(nèi)不能搜尋并登上平臺(tái)，則用手將其引導(dǎo)至平臺(tái)并停留30 s也讓其對(duì)平臺(tái)位置進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶，同時(shí)判定該小鼠逃亡成功。每天每只小鼠實(shí)驗(yàn)4次，每次間隔15~25 min，確保每只實(shí)驗(yàn)小鼠分別從4個(gè)入水口放入，防止小鼠采用非記憶性的策略進(jìn)行逃生；實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行7 d，每天實(shí)驗(yàn)起始時(shí)間應(yīng)相同，確保小鼠對(duì)平臺(tái)位置的記憶獲取。在每次水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)注意立即用毛巾或者吹風(fēng)機(jī)將小鼠毛發(fā)晾干，避免小鼠因?yàn)橹鴽龆绊懡酉聛淼膶?shí)驗(yàn)；(2)記憶鞏固。7 d的訓(xùn)練結(jié)束后將小鼠放回鼠籠，進(jìn)行24 h的記憶鞏固；(3)記憶提取。24 h后去除迷宮內(nèi)的逃生平臺(tái)，在原逃生平臺(tái)的對(duì)側(cè)象限入水口放入小鼠,記錄60 s內(nèi)小鼠運(yùn)動(dòng)狀況，檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。

圖9 水迷宮實(shí)驗(yàn)

A：水迷宮裝置正視圖；B：水迷宮俯視圖(棕色標(biāo)注出隱藏在水面下的逃生平臺(tái)，紅色為小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡)。

2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2.1 ASD小鼠社交行為分析

社交障礙是孤獨(dú)癥譜系障礙核心缺陷之一，患者在社會(huì)認(rèn)知、社交互動(dòng)、眼神接觸、理解和使用非言語(yǔ)溝通等方面存在困難[32]。研究中通常利用三廂社交實(shí)驗(yàn)、居住者–侵入者實(shí)驗(yàn)、筑巢實(shí)驗(yàn)和超聲波發(fā)聲檢測(cè)這幾種方法來對(duì)小鼠模型進(jìn)行社交行為評(píng)估。

在三廂社交實(shí)驗(yàn)中，通過攝像頭實(shí)時(shí)跟蹤、記錄小鼠的行為軌跡，用SuperMaze分析軟件統(tǒng)計(jì)小鼠的社交信息。(1)社交能力檢測(cè)：統(tǒng)計(jì)小鼠在empty室所待的總時(shí)間TE(鼠身進(jìn)入一半即開始計(jì)時(shí)，離開即停止計(jì)時(shí))，以及和stranger1的接觸總時(shí)間TS(小鼠嗅探實(shí)驗(yàn)鼠即開始計(jì)時(shí)，離開即停止計(jì)時(shí))； (2)社交新穎性檢測(cè)：統(tǒng)計(jì)小鼠和stranger1以及 stranger2的接觸總時(shí)間TS1和TS2(計(jì)算方法如(1)中所示)。若TE≥TS表明有嚴(yán)重的社交能力缺陷；若TS1≥TS2則表明有嚴(yán)重的社交新奇性缺陷。孤獨(dú)癥小鼠模型通常社交新穎性能力明顯缺失，并伴隨有一定程度的社交能力障礙。在Fmr1ASD小鼠模型中，Naviaux等[33]發(fā)現(xiàn)Fmr1小鼠接觸時(shí)間TE≈TS、TS2

在居住者–入侵者實(shí)驗(yàn)中，用攝像頭記錄4 d內(nèi)待測(cè)小鼠和侵入者之間的攻擊性(aggressivity be-haviors)[34]和非攻擊性行為(non-aggressive behaviors)的社交行為時(shí)間。非攻擊性的行為包括追逐、尾隨、前肢搭趴、捋毛、鼻–鼻互觸或鼻–下體接觸等[35]，而攻擊性行為包括受試小鼠主動(dòng)撕咬/抓/怒視入侵小鼠等(圖2B)。非攻擊性行為(NS)減少或者攻擊性行為(NA)增加，表明受試小鼠存在社交缺陷。在NL3ASD小鼠模型中，Burrows等[36]發(fā)現(xiàn)NL3小鼠攻擊性行為增加2倍，非攻擊性社交行為無明顯差異，檢測(cè)出明顯的社交缺陷。

在筑巢實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)巢穴評(píng)分系統(tǒng)(nesting score system, NSS)[37](圖10)對(duì)巢穴進(jìn)行評(píng)分(S)，評(píng)分系統(tǒng)粗分為5大類：(1) 0分，小鼠未擾亂或使用筑巢材料；(2) 1分，小鼠擾亂材料但未將其聚集成巢位，材料只是簡(jiǎn)單堆積；(3) 2分，小鼠聚集材料形成平坦巢穴，巢體外觀呈淺碟狀，巢壁不完全或缺；(4) 3分，材料被聚集形成杯狀巢穴，巢壁為可辨識(shí)的杯狀或碗狀：(5) 4分，材料被聚集形成不完全的圓頂巢穴，巢壁匯合超過半球體；(6) 5分，材料被聚集形成完整的圓頂巢穴，巢體四周或頂部只存在一個(gè)可容納一只小鼠進(jìn)出的進(jìn)出口。評(píng)分越低小鼠的社交行為缺陷越嚴(yán)重。在ASD小鼠模型中，Orefice等[9]發(fā)現(xiàn)小鼠筑巢得分顯著減少，檢測(cè)出明顯的社交缺陷。

圖10 小鼠筑巢評(píng)分圖

母子隔離誘導(dǎo)USVs實(shí)驗(yàn)中，可以直接根據(jù)SONOTRACK系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)出生后2、4、6、8和12天時(shí)的如下數(shù)據(jù)：(1)幼崽在5 min內(nèi)發(fā)出叫聲的總數(shù)目(NU)；(2)幼崽在5 min內(nèi)發(fā)出叫聲的總持續(xù)時(shí)間(TU)；(3)根據(jù)Chabout等[38]在2012年將小鼠USVs劃分成10種類型：短音(≤50 ms且≤10 kHz)、平音(≥50 ms且≤10 kHz)、單次跳頻音(瞬時(shí)的一個(gè)頻率改變)、多次跳頻音(多次的頻率改變)、U型音(U型波且≥10 kHz)、V型音(倒U型波且≥10 kHz)、調(diào)制音(幾個(gè)頻率的降低或增加且≥10 kHz)、復(fù)合音(同時(shí)釋放或多個(gè)頻率且≥10 kHz)、上行音(頻率逐漸上升且≥10 kHz)和下行音(頻率逐漸下降且≥10 kHz)，統(tǒng)計(jì)幼崽在5 min內(nèi)發(fā)音的復(fù)雜度(Cu)，每種發(fā)聲類型的總數(shù)目(NTU)和總持續(xù)時(shí)間(TTU)。NU和TU降低，則表明幼崽存在溝通障礙，有明顯的社交缺陷；Cu降低、NTU和TTU與正常幼崽相比有明顯的異常表達(dá)模式，也表明幼崽存在著社交缺陷。

成年小鼠求偶誘導(dǎo)USVs實(shí)驗(yàn)中，同樣根據(jù)系統(tǒng)直接統(tǒng)計(jì)：(1)雄鼠在5 min內(nèi)發(fā)出叫聲的總數(shù)目(NU1)；(2)雄鼠在5 min內(nèi)發(fā)出叫聲的總持續(xù)時(shí)間(TU1)。NU1和TU1降低，則表明雄鼠存在社交缺陷。在Cntnap2ASD小鼠模型中，Brunner等[39]和Penagarikano等[40]發(fā)現(xiàn)Cntnap2幼崽和成年雄鼠USVs數(shù)目下降約1倍，檢測(cè)出明顯的社交缺陷。

2.2 ASD小鼠重復(fù)刻板行為分析

重復(fù)刻板行為是孤獨(dú)癥譜系障礙的核心缺陷之一，具體表現(xiàn)為刻板行為、強(qiáng)迫行為、自傷行為、儀式化行為、同一性行為和狹窄興趣[41]。在小鼠模型中通常用Y-迷宮自發(fā)選擇、捋毛實(shí)驗(yàn)、刻板行為分析和彈珠埋藏這幾種方法來模擬重復(fù)刻板行為[35]。

在Y-迷宮自發(fā)選擇實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)小鼠進(jìn)入相同目標(biāo)臂的次數(shù)比例來表征重復(fù)刻板行為的程度。記錄小鼠在試驗(yàn)總次數(shù)(NT)中進(jìn)入目標(biāo)臂的次數(shù)(NA)比例R (R= NA/NT)，R值越高，表示小鼠的重復(fù)刻板行為越嚴(yán)重。在RIM32ASD小鼠模型中，Zhu等[35]發(fā)現(xiàn)RIM32小鼠R值約為WT鼠的1.3倍，檢測(cè)出明顯的刻板重復(fù)行為。

在捋毛實(shí)驗(yàn)中，用攝像頭記錄30 min內(nèi)小鼠的行為，人為統(tǒng)計(jì)小鼠梳理毛發(fā)所用的時(shí)間(TG)占總時(shí)間的比例，比例越高則刻板重復(fù)行為越嚴(yán)重。在ASD小鼠模型中，Pe?a等[42]發(fā)現(xiàn)小鼠捋毛時(shí)間約為WT鼠的1.7倍，檢測(cè)出明顯的刻板重復(fù)行為。

在刻板行為分析實(shí)驗(yàn)中，用攝像頭記錄30 min內(nèi)小鼠的行為，統(tǒng)計(jì)所觀察到的各項(xiàng)刻板動(dòng)作的次數(shù)、時(shí)間及其總次數(shù)(Nc)和時(shí)間(Tc)作為評(píng)估刻板運(yùn)動(dòng)的指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)的次數(shù)越多時(shí)間越長(zhǎng)則表明重復(fù)刻板行為越嚴(yán)重。在C58/J ASD小鼠模型中，Moy等[43]發(fā)現(xiàn)C58/J小鼠相較于正常品系小鼠旋轉(zhuǎn)、空翻和垂直跳躍增加約4倍，后肢站立增加約2倍，檢測(cè)出明顯的刻板行為。

在彈珠埋藏實(shí)驗(yàn)中，人為統(tǒng)計(jì)30 min內(nèi)小鼠埋藏彈珠的數(shù)目(埋藏深度為70%及以上，Nb)和小鼠挖掘墊料的時(shí)間(Td)，埋藏?cái)?shù)目和挖掘時(shí)間增加則刻板重復(fù)行為越嚴(yán)重。在ASD小鼠模型中，Gkogkas等[44]發(fā)現(xiàn)小鼠埋藏彈珠的數(shù)目約為WT的2倍，檢測(cè)出明顯的刻板重復(fù)行為。

2.3 ASD小鼠焦慮行為分析

焦慮是一種心理生物學(xué)的情緒狀態(tài)或反應(yīng)，包括不愉快的緊張感、擔(dān)憂和神經(jīng)系統(tǒng)的自主激活，是ASD患者中常見的表型。小鼠模型中主要通過將動(dòng)物暴露于自然的、潛在的致焦慮性情況來引起相應(yīng)行為反應(yīng)來檢測(cè)其焦慮水平[45]，有曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和明暗穿梭實(shí)驗(yàn)等。

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，利用SuperMaze系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)和分析不同的觀察指標(biāo)：(1)優(yōu)先統(tǒng)計(jì)在行為箱中小鼠10 min (T)內(nèi)活動(dòng)的總路程(Dt)，根據(jù)時(shí)間計(jì)算小鼠的平均速度V (V=Dt/T)。檢測(cè)小鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力[46]，避免運(yùn)動(dòng)能力的缺陷影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(2)在電腦的SuperMaze軟件上根據(jù)人為劃分的中央?yún)^(qū)(中央直徑約32 cm的圓)和周邊區(qū)(圓外區(qū)域) (圖6B)，統(tǒng)計(jì)小鼠在中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)的距離(Dc)以及在中央?yún)^(qū)所待的時(shí)間(Tc)，計(jì)算出小鼠在中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)的距離占總距離的比例Rd (Rd=Dc/Dt)或者在中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間占總時(shí)間的比例Rt (Rt=Tc/T)，比較小鼠Rd或者Rt，數(shù)值越小的小鼠焦慮程度越高。

在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，同樣通過SuperMaze系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)和分析不同的觀察指標(biāo)：(1)小鼠的平均速度。判斷小鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力；(2)計(jì)算出小鼠在開臂運(yùn)動(dòng)時(shí)間(TO)占總時(shí)間(T)的比例Rto(Rto=TO/T)；(3)小鼠在開臂中運(yùn)動(dòng)的總距離(DO)，計(jì)算出小鼠在開臂運(yùn)動(dòng)的距離占總距離的比例(Rdo= DO/Dt)。Rto、Rdo越小，小鼠的焦慮程度越高[47]。在Arid1bASD小鼠模型中，Jung等[48]發(fā)現(xiàn)Arid1b小鼠在中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)的時(shí)間和距離相比WT鼠減少了約3倍，在開臂運(yùn)動(dòng)的時(shí)間相比WT鼠減少了約4倍，檢測(cè)出明顯的焦慮。

在明暗穿梭實(shí)驗(yàn)中，利用記錄的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)10 min內(nèi)小鼠箱室的轉(zhuǎn)換次數(shù)(Nl)和在明箱中所待的總時(shí)間(Tl)，Nl和Tl降低，則表明小鼠焦慮程度較高。在Cadm1ASD小鼠模型中，Takayanagi等[49]發(fā)現(xiàn)Cadm1小鼠在明箱中呆的時(shí)間相較于WT降低了約8倍，表現(xiàn)出明顯的焦慮。

2.4 ASD小鼠學(xué)習(xí)記憶行為分析

學(xué)習(xí)和記憶障礙也是孤獨(dú)癥患者常見的缺陷之一，其具體表現(xiàn)為大多數(shù)患者學(xué)習(xí)能力較差，記憶能力比如復(fù)雜的視覺和語(yǔ)言信息記憶、空間參考記憶、聯(lián)想學(xué)習(xí)能力、語(yǔ)言工作記憶和識(shí)別記憶存在嚴(yán)重問題[50]。在小鼠模型中較為常見的是用新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)認(rèn)知記憶和參考記憶。

在新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)錄像統(tǒng)計(jì)小鼠在步驟(3)中10 min內(nèi)探索新事物的時(shí)間(TN)和熟悉事物的時(shí)間(TF)，探索時(shí)間包括鼻子或嘴接觸物體和小鼠距離物體2~3 cm范圍內(nèi)探究的時(shí)間(前爪搭在物體上、鼻子嗅物體、舔物體等均屬探究物體，擺個(gè)架勢(shì)或爬到物體上不動(dòng)不能算是對(duì)物體的探究)。若TN與TF相比無明顯差異，即小鼠無法區(qū)分新舊事物，則意味著小鼠的記憶存在障礙。在Arid1bASD小鼠模型中，Jung等[48]發(fā)現(xiàn)Arid1b小鼠探索新事物的時(shí)間TN與TF相比無明顯差異，檢測(cè)出明顯的記憶能力缺失。

在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，通過SuperMaze軟件在記憶獲取階段統(tǒng)計(jì)：(1)根據(jù)小鼠的運(yùn)動(dòng)距離和時(shí)間統(tǒng)計(jì)出小鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力，首先排除小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響；(2)記錄小鼠從入水到登上逃生平臺(tái)所用時(shí)間作為潛伏期(TL)。若小鼠60 s內(nèi)無法自己登上逃生平臺(tái)，則潛伏期記作60 s。潛伏期越長(zhǎng)表明受試小鼠的記憶獲取能力越差。記憶提取階段需用SuperMaze軟件捕捉并記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡和統(tǒng)計(jì)小鼠經(jīng)過原隱藏平臺(tái)位置的次數(shù)。運(yùn)動(dòng)軌跡雜亂無章，路過平臺(tái)次數(shù)(NT)顯著降低表明受試小鼠記憶提取能力越差，表明小鼠空間參考記憶有嚴(yán)重缺陷。

在Arid1bASD小鼠模型中，Jung等[48]發(fā)現(xiàn)Arid1b小鼠探索新事物的時(shí)間TN與TF相比無明顯差異；潛伏期時(shí)間明顯增加，約是WT鼠的3~4倍且記憶提取時(shí)路過平臺(tái)次數(shù)顯著減少，檢測(cè)出明顯的學(xué)習(xí)和記憶能力障礙[48]。

因?yàn)樾∈竽懶∨麦@，對(duì)環(huán)境變化敏感，為了確保行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，需要遵循一些嚴(yán)格的要求：(1)溫度穩(wěn)定在22℃~25℃之間，噪音低于30 dB；(2)實(shí)驗(yàn)組數(shù)量與對(duì)照組相似不低于10只，若是單只小鼠的重復(fù)實(shí)驗(yàn)分析則不低于10次； (3)實(shí)驗(yàn)均采用雄鼠，避免雌鼠發(fā)情期和體內(nèi)激素的干擾；(4)多采用2~6個(gè)月小鼠，年齡過大或過小的小鼠運(yùn)動(dòng)能力有所缺陷，并有證據(jù)證明小鼠的焦慮會(huì)隨年齡的升高而增加[51]；(5)小鼠在暗階段最為活躍且內(nèi)源性激素差異不大，所以行為學(xué)分析實(shí)驗(yàn)應(yīng)該遵循小鼠的光周期；(6)實(shí)驗(yàn)前兩天將小鼠放置實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)熟悉環(huán)境，實(shí)驗(yàn)前對(duì)小鼠的處理應(yīng)保持一致；(7)長(zhǎng)期的社會(huì)隔離會(huì)導(dǎo)致小鼠的社交行為、學(xué)習(xí)記憶能力和焦慮的改變[52]，小鼠飼養(yǎng)保持每籠4~5只；(8)凡是涉及到人工統(tǒng)計(jì)數(shù)需雙盲。

雖然小鼠模型經(jīng)濟(jì)成本、時(shí)間成本、技術(shù)條件、同源性和行為學(xué)觀察總體評(píng)估最優(yōu)，是國(guó)內(nèi)外研究ASD致病機(jī)理最普遍的動(dòng)物模型，但還有很多需要完善和解決的問題。一方面是嚙齒類動(dòng)物和人類在社會(huì)行為和大腦解剖方面有明顯的進(jìn)化差異，這些行為和解剖學(xué)差異已經(jīng)成為關(guān)于嚙齒動(dòng)物模型在研究孤獨(dú)癥方面的爭(zhēng)論問題[53]。另外，ASD患者已經(jīng)被證實(shí)患有大量的并發(fā)癥，比如睡眠、感知覺異常和肌肉張力問題等。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，我們也可以利用睡眠剝奪[54]、刺激獎(jiǎng)賞[55]、步態(tài)檢測(cè)和絲網(wǎng)測(cè)試[56,57]來檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠是否存在ASD相關(guān)的并發(fā)癥。

3 應(yīng)用

3.1 孤獨(dú)癥譜系障礙基因工程小鼠模型行為學(xué)表型總結(jié)

小鼠的行為學(xué)方法廣泛應(yīng)用于各種孤獨(dú)癥譜系障礙基因工程小鼠模型中，不同的小鼠模型在社交缺陷、重復(fù)刻板、焦慮以及學(xué)習(xí)和記憶障礙等行為上具有相似的表型，但也存在明顯的差異。表1~ 表3分別總結(jié)了已有孤獨(dú)癥基因工程小鼠模型在社交和重復(fù)刻板行為以及焦慮和學(xué)習(xí)記憶行為測(cè)試中的表型，這些行為差異可能與其遺傳病理相關(guān)。

表1 ASD小鼠模型社交行為檢測(cè)

TE、TS表示小鼠在空室、含同類小鼠的室所待的時(shí)間；TS1、TS2表示小鼠與熟悉小鼠、陌生小鼠所待的時(shí)間；NA、NS表示小鼠攻擊性行為、非攻擊性社交行為的次數(shù)；S表示小鼠筑巢得分?jǐn)?shù)；NU、TU表示單位時(shí)間內(nèi)母子分離后幼崽發(fā)出的超聲波數(shù)目和持續(xù)時(shí)間；Cu表示幼崽超聲波發(fā)聲的種類；NU1表示成年小鼠求偶發(fā)出的超聲波數(shù)目；↑表示數(shù)目增加；↓表示數(shù)目減少。

表2 ASD小鼠重復(fù)刻板行為檢測(cè)

TG表示小鼠的捋毛時(shí)間；R表示小鼠未發(fā)生選擇改變的比例；Nc表示小鼠的刻板行為的次數(shù)統(tǒng)計(jì)；↑表示數(shù)目增加；↓表示數(shù)目減少；Nb表示小鼠單位時(shí)間內(nèi)埋藏彈珠的數(shù)目。

表3 ASD小鼠焦慮、學(xué)習(xí)記憶行為檢測(cè)

續(xù)表

Rt表示小鼠在中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)的時(shí)間占總時(shí)間的比例；Rto表示小鼠在開臂運(yùn)動(dòng)的時(shí)間占總時(shí)間的比例；Nl、Tl表示小鼠進(jìn)入明箱的次數(shù)、時(shí)間；TN、TF表示小鼠對(duì)新事物、舊事物探索的時(shí)間；TL、NT表示小鼠潛伏期時(shí)間、記憶提取時(shí)路過目標(biāo)平臺(tái)附近的次數(shù)。

3.2 孤獨(dú)癥譜系障礙小鼠行為學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用前景

近些年行為學(xué)檢測(cè)方法在不斷成熟與完善，實(shí)驗(yàn)趨向低損傷、操作更加簡(jiǎn)單、統(tǒng)計(jì)更快捷以及得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加可靠。同時(shí)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)也不斷得到改進(jìn)，例如Noldus的EthoVision分析軟件，通過接收視頻信號(hào)，對(duì)每一幀進(jìn)行數(shù)字化，并分析生成的像素來確定被跟蹤動(dòng)物的位置(以及其他數(shù)據(jù))。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中可以獲得動(dòng)物在特定區(qū)域的運(yùn)動(dòng)路程、運(yùn)動(dòng)軌跡、站立次數(shù)、時(shí)間、速度和進(jìn)入該區(qū)域的頻次等，使得行為學(xué)的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果包含更多信息[102]。

行為學(xué)方法的引入為實(shí)驗(yàn)室研究ASD的致病機(jī)理提供了多元化方向：(1)根據(jù)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的ASD相關(guān)基因，結(jié)合基因工程的技術(shù)在動(dòng)物模型上進(jìn)行基因的編輯，根據(jù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷是否有ASD樣行為，然后對(duì)該基因的上下游進(jìn)行分析，尋找完整的分子環(huán)路。(2)利用反義核酸等技術(shù)，在一定時(shí)間內(nèi)臨時(shí)阻斷某個(gè)特定基因的表達(dá)并根據(jù)行為學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，快速并直觀的篩選出與ASD相關(guān)的基因，并可與相應(yīng)的遺傳工程動(dòng)物模型進(jìn)行比較，同時(shí)也促進(jìn)了動(dòng)物學(xué)、分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)的交叉和結(jié)合[103]。(3)以膜片鉗技術(shù)與動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，通過在特定腦區(qū)注射相應(yīng)的病毒，人為控制特定基因的表達(dá)，并根據(jù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用離體腦片的膜片鉗記錄電位的傳遞并通過免疫染色技術(shù)構(gòu)建出相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)和類型，在分子、細(xì)胞和神經(jīng)環(huán)路的水平上闡述ASD的致病機(jī)理。

行為學(xué)方法的引入也極大促進(jìn)了ASD臨床治療的研究，ASD動(dòng)物模型產(chǎn)生的行為學(xué)數(shù)據(jù)是神經(jīng)精神藥物開發(fā)的基石，采用動(dòng)物行為學(xué)進(jìn)行ASD藥物的研發(fā)與檢測(cè)具有更全面、可靠和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在國(guó)際科學(xué)界受到廣泛應(yīng)用。熟練的掌握這這些行為學(xué)檢測(cè)方法，有助于闡釋ASD致病機(jī)理和尋找治療方法的研究。

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Behavioral analyses in mouse models of autism spectrum disorders

Jianfei Wang, Junhai Han, Zichao Zhang

Autism spectrum disorder is a group of genetically-related developmental disorders of the nervous system. Patients mainly present with core symptoms such as social behavior defects, repetitive stereotyped behaviors, and learning and memory disorders. The mouse models are critical for the studies of the pathogenic mechanisms and potential therapeutic strategies of autism spectrum disorder. The assessments of mouse behaviors provide understandings of the effects of different genetic manipulations as well as pathogenic mechanisms of these diseases. This article describes various mouse behavioral assays corresponding to the core symptoms of ASD patients and provides a detailed description of protocols, cautions, and data analysis for those assays, thereby helping researchers to establish their own experimental designs. In addition, behavioral phenotypes of currently known ASD mouse models are summarized to provide a reference for researchers in the field.

autism spectrum disorder; mouse behavioral analysis; social disorder; repetitive behavior; learning and memory; anxiety

2020-11-18;

2021-02-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31871374，81730034)和江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：BK20170080)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31871374, 81730034), and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20170080)]

王劍飛，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：孤獨(dú)癥致病機(jī)制。E-mail: w13912971049@163.com

張子超，博士，副研究員，研究方向：分子神經(jīng)生物學(xué)。E-mail: zhangzc@seu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-391

2021/3/22 15:20:40

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210319.1153.002.html

(責(zé)任編委: 許琪)