基于網絡藥理學探討附子治療慢性心力衰竭的機制

童晶晶，黎 軍，周裕文，黃雪娟

（南方醫科大學順德醫院附屬陳村醫院，廣東 佛山 528000）

慢性心力衰竭是由各種原因引起心臟結構重構異常，導致心臟功能不全的一種臨床綜合征，是大多數心血管疾病進展的晚期階段。成人慢性心力衰竭的患病率高達0.9%，且該數字可隨著人群年齡的增長而增加[1]。目前，臨床上仍以利尿劑、強心藥、血管擴張藥及血管緊張素轉化酶抑制劑等西藥為主對慢性心力衰竭患者進行治療，但這類藥物僅可控制其癥狀，無法延緩其病情的進展及根治其病情[2]。近年來，中醫藥在慢性心力衰竭的治療中取得較大的進展。中醫藥具有長效、副作用少等特點，不僅注重改善患者的臨床癥狀，而且注重調理其體質，提高其生活質量。慢性心力衰竭的癥狀與中醫“心水”的臨床表現相似。不少醫家認為，中醫辨證心水以陽虛立論[3]。附子是補火助陽的經典中藥。名老中醫李可方基于心力衰竭以陽虛為本這一理論，重用附子治療慢性心力衰竭，取得顯著的療效。這說明，用附子治療慢性心力衰竭具有廣闊的應用前景。不過，用附子治療慢性心力衰竭時，該藥物的活性成分及作用靶點尚待相關研究人員進行進一步的探討。本研究利用網絡藥理學構建了附子- 慢性心力衰竭- 靶點，為進一步探討附子治療心力衰竭的機制奠定了基礎。

1 方法

1.1 建立附子的信息數據集

BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）是國內科學家開發的首個探討中藥分子機制的在線分析工具。BATMAN-TCM 的主要功能包括中藥組成成分的靶標預測和潛在靶標的功能分析，還可進行成分-靶標-通路/ 疾病關聯網絡的可視化分析。利用BATMAN-TCM 建立附子信息數據集，在BATMAN-TCM 的搜索框內輸入“附子”，將檢索條件設置為系統默認值（即調整后的P 值≤0.05，Score cutoff ≥20），即可得出附子的活性成分- 靶標信息數據集。

1.2 建立慢性心力衰竭的生物信息數據集

CTD（http://ctdbase.org/）可用于選擇與慢性心力衰竭相關的靶標。CTD 是一個開放式數據庫，可提供不同類型分子的集中式集成數據及來自各種生物的毒理學數據。CTD整合了有關化學基因、蛋白質相互作用、化學疾病和基因疾病相互作用的信息。在CTD 搜索框內輸入 “心力衰竭”、“慢性心力衰竭”、“充血性心力衰竭”及“心肌衰竭”等關鍵詞，以獲得與慢性心力衰竭相關的靶標。

1.3 獲取附子-慢性心力衰竭- 基因數據集的蛋白互作網絡（PPI）

Draw Venn Diagram 在線工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/Venn/）可用于分析慢性心力衰竭和附子的交叉基因集，構建附子- 慢性心力衰竭- 基因數據集。將構建的數據集輸入String 數據庫（https://string-db.org/）。STRING 數據庫是一個可預測蛋白質的直接和間接相互作用、建立蛋白質之間網絡的數據庫，擁有來自2031種生物的9 443 763 個蛋白質。選擇綜合得分（Combined score）＞0.4 分的蛋白質構建PPI[4]。

1.4 用基因本體論（Geneontology，GO）分析附子-慢性心力衰竭- 基因的生物學過程

GO 是在生物學領域應用廣泛的進行基因功能分類和基因產物功能描述的系統。 Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一種高效且直觀的基因富集分析在線工具，具有集成發現和注釋的功能，專注于對基因功能和GO 術語的解釋。將慢性心力衰竭和附子的交叉基因集輸入Metascape，對其進行GO 分析[5]。

1.5 用京都基因與基因組百科全書（KEGG）探討附子-慢性心力衰竭-基因的生物學通路

KEGG 是一個基因功能系統分析知識庫。該數據庫將基因組信息與高階功能信息聯系起來，從而獲得豐富的生物學途徑。將慢性心力衰竭和附子的交叉基因集輸入Funrich 插件，確定其KEGG 途徑，篩選標準為P ≤0.05。

2 結果

2.1 附子的生物信息集

在用BATMAN-TCM 進行檢索與篩選后，共獲得85個附子的化合物，其中有27 個化合物因無明確的化學結構而被剔除，最終納入58 個化合物，包括Talatisamine、Benzoylaconine、Aconitine、Delphin、Delgrandine、Aconine、14-Deoxy-11、12-Didehydroandrographolide、Delbruline、Deltaline、Delavaconitine、Deltamine、Uracil、Carmichaeline、Delsoline、Delcorine、Karanjin、Salsolinol、Crassicauline A、2,7-Dideacetyl-2,7-Dibenzoyl-Taxayunnanine F、Delphamine、Bullatine B、Benzoylhypaconine、Bullatine C、Coryneine、Vilmorrianine C、3-Acetylaconitine、Deoxyaconitine、Denudatine、Delsemine B、Delphatine、Delsemine A、Demethyldelavaine A、M-Aminophenol、Karakoline、Hypaconitine、Talatizamine 等（見圖1）。附子所對應的靶點共有253 個，包括ABCB1、ABCC9、ACE、ACHE、ADIRF、ADORA2A、ADORA2B、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A 等（見圖1）。

圖1 附子-化合物-基因相互作用網絡

2.2 慢性心力衰竭的生物信息集

通過CTD 數據庫獲得與慢性心力衰竭相關的生物信息集，共篩選出113 個與慢性心力衰竭有關的基因。將這113個基因導入Cytoscape 3.7.1 中進行可視化。與慢性心力衰竭相關的靶標包括ACAA1B、ACACA、ACADS、ACE、ACLY、ADIPOQ、ADRA2C、ADRB1、ADRB3、AGT、AGTR1、ALB 及ALDH1A7（見圖2）。

2.3 附子-慢性心力衰竭- 基因數據集的PPI

將附子的總靶點列表與慢性心力衰竭的相關基因靶點列表導入VENN 后，得出與附子- 慢性心力衰竭相互交聯的基因有17 個重疊靶標，包括ACE、NR3C2、NPPA、ADRA2C、ADRB1、TNF、HTR2B、ADRB3、PTGS2、IL-1β、AGTR1、IFNG、ALB、PTGS1、NRG1、CRP、IL6。 這17個重疊靶標代表了附子治療慢性心力衰竭的核心機制和潛在目標（見圖3）。

圖2 慢性心力衰竭的基因靶點集

圖3 附子-慢性心力衰竭-基因的PPI 圖

2.4 附子- 慢性心力衰竭- 基因的生物學過程

慢性心力衰竭和附子重疊靶標的生物學功能顯著富集于調節血管收縮、調控炎癥反應、調節血壓水平及脂肪的分解中，并可維持多細胞生物體內的平衡，參與鈣介導的信號傳導和內分泌過程、干細胞分化，同時參與受體介導的內吞作用、髓樣白細胞介導的免疫反應等（見圖4）。

圖4 附子-慢性心力衰竭-基因的生物學過程

2.5 附子- 慢性心力衰竭- 基因的生物學通路

通過對附子-慢性心力衰竭的交叉基因進行Funrich 分析后發現，二者的重疊靶點共參與了4 條途徑，包括IL-27信號通路途徑、IL-23 信號通路途徑、調控腎上腺皮質激素受體途經、調控生物胺結合受體途經（見圖5）。

圖5 附子-慢性心力衰竭-基因的生物學通路

3 討論

根據中醫辨證論治的原則，慢性心力衰竭屬于“心水”的范疇。該病以心氣心陽虛為本，以血瘀、水停、痰飲為標，治當益氣溫陽、活血利水。附子味辛、性大熱，是回陽救逆的有效藥物之一，廣泛用于慢性心力衰竭或心肌梗死的治療[6]。但目前臨床上尚未系統地闡明附子治療慢性心力衰竭的物質基礎和靶點[7]。本文擬構建附子-慢性心力衰竭-靶點網絡，從而系統地分析附子治療慢性心力衰竭的作用機制。

與附子- 慢性心力衰竭相互交聯的基因有17 個靶點，分別為ACE、NR3C2、NPPA、ADRA2C、ADRB1、TNF、HTR2B、ADRB3、PTGS2、IL-1β、AGTR1、IFNG、ALB、PTGS1、NRG1、CRP、IL-6。附子- 慢性心力衰竭- 基因數據集的功能包括類固醇激素受體激活、心率調節和血壓調節。這些功能還與心肌細胞代謝、心電圖活動、血液灌注、炎癥反應及氧化應激反應有關。此外，附子- 慢性心力衰竭- 基因數據集具有相似的生物學過程和多靶標協同的特性。例如，CRP、IL-1β 及IL-6 水平的升高可誘導心肌細胞的凋亡，降低心室壁的順應性，并可引起冠狀動脈微血管內皮的炎癥反應。靶向CRP、IL-6 和IL-1β 具有減輕心臟循環系統炎癥反應的作用，并可改善心室的適應性[8]。腎素- 血管緊張素系統具有調節血管收縮、維持內環境穩定的作用。在慢性心力衰竭的狀態下，腎素-血管緊張素系統被激活，參與心臟前后負荷的形成，故治療指南中明確指出，血管緊張素轉化酶抑制劑是治療慢性心力衰竭的基本藥物，靶向血管緊張素轉化酶是治療該病的一個重要靶標，而ACE、AGTR1 參與調節腎素-血管緊張素系統[9-10]。NR3C2 的激活與過度炎癥反應、纖維化及靶器官損傷的發生均具有密切的關系。NPPA 是心力衰竭的敏感標志物。慢性心力衰竭患者的病情嚴重時，其NPPA 的水平可明顯上升。通過抑制NR3C2 的表達，可減輕心肌間質纖維化的程度[11-12]。研究表明，使用可抑制PTGS1 和PTGS2 活性的非甾體抗炎藥可增加慢性心力衰竭的發病風險。其原因為，這兩種酶類可減少具有心臟保護作用的前列腺素E 的產生。ADRA2C 和ADRB1 均參與心肌收縮力、心率和血壓的調節過程。TNF 參與心臟重塑的過程。這表明，與附子- 慢性心力衰竭相互交聯的重疊靶標的生物學功能在治療慢性心力衰竭中具有重要的作用[13-15]。研究證實，使用5-HT2B受體阻滯劑可明顯改善心臟肥大的癥狀，減輕氧化應激反應的程度和細胞外細胞基質活化的程度。ADRB3 具有抑制心肌纖維化的作用[16-17]。內皮素拮抗劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、高級糖基化終產物抑制劑等治療慢性心力衰竭和糖尿病相關性心臟病的藥物大多作用于上述的途徑。本次研究的結果表明，附子可作用于上述的多靶點、多通路，具有治療慢性心力衰竭的潛在作用。

進行GO 分析的結果顯示，附子治療慢性心力衰竭的生物過程與其調節血管收縮、炎癥反應發生、血壓的水平及脂肪的分解、鈣介導的信號傳導、內分泌的過程、免疫反應等相關。進行KEGG 通路富集分析的結果顯示，共篩選出4 條信號通路途經，包括IL-27 信號通路途徑、IL-23信號通路途徑、調控腎上腺皮質激素受體途經和調控生物胺結合受體途經。GO 和KEGG 富集的結果與附子- 慢性心力衰竭- 基因數據集涉及的生物功能相似。因此，我們推測，附子的活性成分可能通過作用于這些信號通路中的關鍵因子，達到治療慢性心力衰竭相的目的。本研究應用網絡藥理學的方法對附子治療慢性心力衰竭的多成分、多靶點、多途徑進行了初步的探討。本次研究的結果初步預測了附子治療慢性心力衰竭的分子機制，為進一步探討其作用機制提供了先導信息和基礎，也為研究成分更為復雜的中藥復方的作用機制提供了借鑒。