利用生物信息學分析方法研究糖酵解相關基因在宮頸癌組織中的表達譜

韓小玲，凌志甫，韓俏英

（廣東醫(yī)科大學，廣東 東莞 523808）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一。近幾年，該病的發(fā)病率和死亡率均呈逐漸上升的趨勢。據統(tǒng)計，全球每年約有53 萬新發(fā)宮頸癌患者，每年約有27.5 萬宮頸癌患者死亡[1]。近三十年來，我國宮頸癌的發(fā)病率提高了10% ～40%，每年新發(fā)宮頸癌患者的數(shù)量超過14 萬，每年死亡的宮頸癌患者數(shù)量約為3.7 萬。宮頸癌已成為我國年輕女性發(fā)病率較高的婦科惡性腫瘤之一[2]。積極地探索宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的機制、新的診斷和治療靶點具有重要的臨床意義。腫瘤組織的代謝情況與正常組織不同，具有代謝重編程的顯著特點。腫瘤組織即使在有氧的條件下，仍以糖酵解為主要代謝方式，即存在Warburg 效應[3]。糖酵解是腫瘤組織特有的代謝方式。腫瘤組織糖酵解的程度與其進展情況具有密切的聯(lián)系。有多個糖酵解相關基因會參與調控糖酵解，并影響宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。但目前對于這些基因在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展中的具體作用仍未可知。生物信息學分析方法是基于高通量芯片和測序技術發(fā)展起來的一種研究方法。生物信息學分析方法的出現(xiàn)為人們探索疾病的發(fā)展過程提供了新的方法。本文主要是利用生物信息學分析方法研究多個糖酵解相關基因在宮頸癌組織中的表達譜。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據來源

從腫瘤基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載2020年11 月20 日前收集的宮頸癌轉錄組數(shù)據。數(shù)據類型為FPKM 形式。該數(shù)據集來自3 例正常宮頸樣本和306 例宮頸癌樣本。然后將下載后的轉錄組數(shù)據進行基因重注釋。從基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）數(shù)據庫（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下載與糖酵解相關的基因集。該數(shù)據集包括383 個糖酵解相關基因。提取TCGA 數(shù)據庫宮頸癌數(shù)據集中存在上述糖酵解相關基因的表達譜。

1.2 生物信息學分析方法

利用R 軟件中的limma 包對383 個糖酵解相關基因進行差異分析。刪除在樣本中表達較低的基因，按照過濾條件（差異倍數(shù)絕對值大于1.5，且P 值＜0.01）篩選基因。借助R 軟件的clusterprofiler 包對識別出的差異基因進行GO 功能和KEGG 通路富集分析?；谠诰€網站String（https://string-db.org/）構建的糖酵解相關差異基因蛋白互作網，利用cytoscape 軟件中的cytohubba 插件對這些差異基因進行蛋白互作網絡分析。按照degree 大于10 的標準，識別蛋白互作網絡中的核心基因。

2 結果

2.1 篩選差異基因的結果

本次研究中共篩選出76 個差異基因。其中包括54 個基于正常宮頸組織基因上調的差異基因，22 個基于正常宮頸組織基因下調的差異基因。

2.2 對這些差異基因進行GO 功能和KEGG 通路富集分析的結果

對這些差異基因進行GO 功能富集分析的結果顯示，這76 個差異基因顯著富集在能量代謝、能量合成等生物學過程中。詳見表1。對這些差異基因進行KEGG 通路富集分析的結果顯示，這76 個差異基因顯著富集在與氨基酸、糖代謝相關的通路上。詳見表2。

表1 對這些差異基因進行GO 功能富集分析的結果

表2 對這些差異基因進行KEGG 通路富集分析的結果

2.3 對這些差異基因進行蛋白互作網絡分析的結果

在這些差異基因中， 有CDK1、NDC1、NUP107、PFKM、IGF1 和HK2 六個可識別的蛋白互作網絡核心基因。

3 討論

近年來，高通量芯片和測序技術得到飛速的發(fā)展，TCGA 及GEO 等公共腫瘤數(shù)據庫存儲的腫瘤組織轉錄組數(shù)據不斷完善，科研人員已經可以借助這些技術和平臺對腫瘤基因進行生物信息學分析。這為臨床上進行腫瘤學研究開辟了一個新的思路。使用生物信息學分析方法進行科研所需的經費少，耗時較短，無需科研人員自己在臨床上尋找病例。TCGA 是由美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）和國家人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）合作繪制出的涵蓋多種腫瘤類型及亞型、多維度關鍵基因組變化的圖譜。TCGA是目前最大的儲存癌癥基因信息的數(shù)據庫。TCGA 中收集了大量各種癌癥的基因表達數(shù)據、miRNA 表達數(shù)據、拷貝數(shù)變異數(shù)據、DNA 甲基化數(shù)據、SNP 數(shù)據及臨床研究數(shù)據[4-5]?？蒲腥藛T可以通過對TCGA 數(shù)據庫中的相關數(shù)據進行分析和整合，探索腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、風險分層、治療策略及患者的預后等。宮頸癌是臨床上常見的婦科惡性腫瘤之一。目前臨床上主要使用手術、放療、化療等多種治療方法治療宮頸癌。在發(fā)病早期和中期接受科學有效治療的宮頸癌患者通常可以獲得較好的預后。但在病情進展到晚期才接受治療的宮頸癌患者在發(fā)病后5 年的生存率仍較低[6]。探索對宮頸癌患者進行治療的新靶點具有重要的意義。與正常組織進行有氧氧化代謝不同，腫瘤組織代謝的方式傾向于進行無氧糖酵解。與腫瘤組織糖酵解相關的課題是目前腫瘤學研究領域中比較熱門的課題。目前關于糖酵解與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及結局關系的研究比較缺乏，現(xiàn)有的部分研究往往將研究目標集中在單個分子上。生物信息學分析方法是基于高通量芯片和測序技術發(fā)展起來的一種研究方法。該方法為科研人員研究多個分子與疾病的相關性提供了便利。本次研究中，我們提取TCGA 數(shù)據庫中宮頸癌轉錄組多個糖酵解相關基因的數(shù)據，利用生物信息學方法系統(tǒng)地分析了多個糖酵解相關基因在宮頸癌組織中的表達情況、功能及通路等，為深入開展宮頸癌領域的研究奠定了基礎，也為臨床進一步選取治療靶點打開了新的思路。

本次研究中，我們利用R 軟件中的limma 包對數(shù)據樣本進行差異分析，篩選出了76 個差異基因。其中包括54個基于正常宮頸組織基因上調的差異基因，22 個基于正常宮頸組織基因下調的差異基因。這從基因角度印證了多個糖酵解相關基因可參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。對這些差異基因進行KEGG 通路富集分析的結果顯示，這76 個差異基因顯著富集在與氨基酸、糖代謝相關的通路上。富集在這些通路中的HK2 又被稱為己糖激酶，可催化己糖磷酸化。HK2 是糖酵解途徑中的第一個酶，也是糖酵解途徑的限速酶。正常情況下，HK2 在哺乳動物中呈高度保守的特性。相關的研究結果顯示，HK2 基因可拮抗經線粒體途徑的細胞凋亡[7]。在腫瘤細胞中，約60% 的ATP 來源于糖酵解過程。已有研究證實，在被切除的肺、胃腸及乳腺惡性腫瘤組織中，HK2 的含量明顯增高[8-9]。富集在這些通路中的PCK2 即線粒體磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶2，是糖異生途徑中的關鍵限速酶。PCK2 是健康組織代謝過程中連接三羧酸循環(huán)、糖酵解和糖異生的樞紐分子，可為組織代謝提供足夠的能量和中間體[10]。PCK2 在多種腫瘤組織中均呈異常表達。PCK2 既具有促進腫瘤進展的作用，又具有抑制腫瘤進展的作用。本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，與正常的宮頸組織相比，宮頸癌組織中的PCK2 呈高表達趨勢。這提示，PCK2 在宮頸癌組織中或許屬于一種抑癌分子。本次研究中，我們利用cytoscape 軟件中的cytohubba 插件對這些差異基因進行蛋白互作網絡分析，結果識別出CDK1、NDC1、NUP107、PFKM、IGF1 和HK2 六個核心基因。在目前對宮頸癌的相關研究中，針對上述6 個基因開展的研究均較少。這些基因可作為今后研究宮頸癌發(fā)生機制的重要靶點。

綜上所述，宮頸癌組織中存在多個與正常宮頸組織基因存在差異的糖酵解相關基因。這些差異基因顯著富集在與能量代謝相關的功能和通路上。在這些差異基因中，有CDK1、NDC1、NUP107、PFKM、IGF1 和HK2 六個可識別的蛋白互作網絡核心基因。