二甲雙胍對H2O2誘導的TM3小鼠睪丸間質細胞氧化應激和細胞凋亡的影響

穆楊，楊菁

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢 430060)

肥胖不僅會導致糖脂代謝異常、心血管風險增加，還會對生殖系統產生較大的負面影響[1-5]。氧化損傷是肥胖患者發生不育的重要機制之一[6]。最新研究表明，氧化應激可降低男性肥胖患者的雄激素水平，進而損害其生育能力[7]。除較常見的肥胖，造成睪丸氧化應激損傷的因素還包括高齡、精索靜脈曲張、不良生活習慣、放化療等。

二甲雙胍是胰島素增敏劑，臨床上常用于治療Ⅱ型糖尿病，也用于單純性肥胖的輔助治療。近期有研究表明，二甲雙胍可以抑制靶細胞的氧化應激過度激活，對靶細胞具有保護作用[8-9]。但二甲雙胍對氧化應激導致的睪丸間質細胞損傷有怎樣的作用及相關作用機制，目前仍未見報道。本研究通過過氧化氫(H2O2)誘導TM3小鼠睪丸間質細胞氧化應激損傷，構建體外細胞模型，觀察二甲雙胍對TM3小鼠睪丸間質細胞的保護性作用。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞來源：TM3小鼠睪丸間質細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2.主要試劑：DMEM培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，CCK8檢測試劑盒購自日本同仁生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒均購自南京建成生物技術有限公司；抗Cleaved-caspase3兔單克隆抗體(9579)和抗GAPDH兔單克隆抗體(5174)購自美國Cell Signaling Technology公司；二甲雙胍(HY-B0627)購自美國MedChemExpress公司，其純度>97.0%。其余實驗試劑的純度均為分析純。

二、研究方法

1.TM3細胞培養與分組處理：TM3細胞種在6孔板上后，用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基在37℃、5%CO2的條件下培養48 h。細胞隨機分為4組：正常對照組、二甲雙胍組、H2O2模型組及H2O2+二甲雙胍組。正常對照組細胞給予PBS處理，二甲雙胍組細胞添加終濃度100 μmol/L的二甲雙胍，H2O2模型組細胞添加終濃度為200 μmol/L的H2O2，H2O2+二甲雙胍組細胞同時添加H2O2(終濃度為200 μmol/L)和二甲雙胍(終濃度為100 μmol/L)，干預時間為24 h。二甲雙胍溶液的配制方法：用PBS配成1 mmol/L的母液，置于-20℃冰箱內，一周內用完。H2O2使用濃度參考之前文獻[10]采用200 μmol/L。

2.睪酮檢測：取各組細胞的培養上清液，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)法檢測上清液中睪酮的含量，具體操作按照商業化的試劑盒說明書進行，實驗重復6次。

3.細胞存活率檢測：TM3細胞種在96孔板上后，細胞密度控制在1×105/孔左右，細胞培養及分組干預處理同上，采用CCK8試劑盒檢測TM3細胞存活率，實驗重復6次，實驗操作步驟按照試劑盒說明書進行。

4.SOD和CAT活性及MDA含量的檢測：各組細胞經胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，2 683g離心5 min，收集細胞超聲裂解后，4℃，1 200g離心5 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定SOD、CAT活性和MDA含量，實驗重復6次。

5.實時定量PCR檢測睪酮合成酶StAR、P450scc及17β-HSD mRNA表達：收集各組細胞并用PBS清洗3遍后，采用TRIzol裂解液提取細胞總RNA，逆轉錄獲得cDNA。隨后采用LightCycler480PCR儀進行擴增，反應條件如下：95℃預變性10 min，然后按照95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s的順序循環反應45次。實驗引物序列如下：GAPDH：上游5′-AGGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；下游5′-GCGTGGTCCAGGGTTTCTTACT-3′；StAR：上游5′-TGTCAAGGAGATCAAGGTCCTG-3′；下游5′-CGATAGGACCTGGTTGATGAT-3′；P450scc：上游5′-AGGTGTAGCTCAGGACTTCA-3′；下游5′-AGGAGGCTATAAAGGACACC-3′；17β-HSD：上游5′-ATTTTACCAGAGAAGACATCT-3′；下游5′-GGGGTCAGCACCTGAATAATG-3′。本研究采用GAPDH作為內參對照，實驗重復6次。

6.Western blot檢測Cleaved-caspase3蛋白的表達：收集各組細胞，加入RIPA細胞裂解液，利用4℃超聲裂解后，12 000g離心30 min吸取上清液。隨后，采用BCA法測定蛋白濃度。利用10% SDS-PAGE進行蛋白分離，半干法轉膜，5%脫脂牛奶封閉30 min，一抗Cleaved-caspase3(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)孵育4℃過夜，TBS-T洗膜3次，每次5 min，HRP標記的二抗(1∶10 000)常溫孵育2 h，洗膜后采用ECL顯色液進行化學發光顯色，利用凝膠自動分析成像系統對蛋白條帶進行采集和灰度值分析，GAPDH作為內參，計算目標蛋白的相對表達量，進行統計分析。

三、統計學方法

結 果

一、各組TM3細胞的睪酮分泌水平比較

與正常對照組相比，H2O2模型組TM3細胞的睪酮分泌顯著降低(P<0.05)；與H2O2模型組相比，H2O2+二甲雙胍組細胞分泌的睪酮含量顯著升高(P<0.05)；正常對照組與二甲雙胍組間的睪酮含量無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05圖1 各組TM3小鼠睪丸間質細胞的睪酮分泌水平比較

二、各組TM3細胞中睪酮合成酶StAR、P450scc和17β-HSD的mRNA表達水平比較

與正常對照組相比，H2O2模型組TM3細胞睪酮合成酶StAR、P450scc和17β-HSD的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2模型組相比，H2O2+二甲雙胍組細胞睪酮合成酶的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；而正常對照組與二甲雙胍組間睪酮合成酶mRNA表達水平無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05圖2 各組TM3小鼠睪丸間質細胞睪酮合成酶StAR、P450scc和17β-HSD的mRNA表達水平

三、各組TM3細胞內SOD、CAT活性和MDA含量的比較

與正常對照組相比，H2O2模型組細胞內SOD和CAT活性顯著降低，而MDA水平顯著升高(P<0.05)；與H2O2模型組相比，H2O2+二甲雙胍組細胞內SOD和CAT活性顯著升高，而MDA含量顯著降低(P<0.05)；正常對照組與二甲雙胍組間細胞內SOD、CAT活性和MDA含量相近，無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

四、TM3細胞存活率和凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3的表達

CCK8實驗結果顯示，與正常對照組相比，H2O2模型組TM3細胞存活率顯著降低[(56.0±9.4)% vs.(100.0±3.4)%](P<0.05)，而H2O2+二甲雙胍組細胞存活率顯著高于H2O2模型組[(82.3±3.2)% vs(56.0±9.4)%](P<0.05)；正常對照組與二甲雙胍組間TM3細胞的存活率比較無顯著性差異(P>0.05)(圖4A)。Western blot結果顯示，與正常對照組相比，H2O2模型組TM3細胞凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3表達水平顯著上調(P<0.05)；與H2O2模型組相比，H2O2+二甲雙胍組TM3細胞內Cleaved-caspase3表達水平顯著下調(P<0.05)；正常對照組與二甲雙胍組間TM3細胞凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3的表達無顯著性差異(P>0.05)(圖4B)。

與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05圖3 各組TM3小鼠睪丸間質細胞內SOD、CAT活性和MDA含量比較

A：各組TM3細胞存活率比較；B：Western blot檢測Cleaved-caspase3與GAPDH的蛋白條帶圖以及各組TM3細胞中Cleaved-caspase3的蛋白相對表達量比較。與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05圖4 各組TM3小鼠睪丸間質細胞存活率和Cleaved-caspase3蛋白表達水平比較

討 論

近年來，肥胖導致的男性不育已引起廣泛關注，而雄激素水平下降是肥胖男性不育的主要原因之一[11]。睪丸間質細胞是男性體內合成雄激素最為重要的生殖細胞，肥胖患者睪丸組織中間質細胞功能存在異常。肥胖男性體內伴有氧化應激的過度激活[12]，氧化應激是導致睪丸間質細胞受損的重要原因[13-14]?；诖?，我們利用H2O2刺激小鼠睪丸間質細胞來模擬睪丸局部氧化應激微環境。通過研究發現，H2O2處理后TM3小鼠睪丸間質細胞的存活率和功能明顯異常，提示肥胖患者睪丸局部氧化應激微環境確實是睪丸間質細胞功能異常的原因之一。

二甲雙胍是臨床上用于治療糖尿病的常見雙胍類口服降糖藥，能顯著提高胰島素敏感性。研究發現二甲雙胍可顯著降低肥胖患者的體重及全身脂肪重量，此外，二甲雙胍對肥胖患者的脂質代謝也有明顯的改善作用，可顯著降低肥胖患者的血清總膽固醇、甘油三酯水平[15]。還有研究報道二甲雙胍可減輕肥胖導致的睪丸血睪屏障受損[16]。我們的前期研究也發現二甲雙胍可改善肥胖導致的脂質代謝及性激素紊亂，減輕睪丸局部的炎癥反應進而提高肥胖大鼠睪丸的生精功能[17]。有研究表明，二甲雙胍可以抑制氧化應激的過度激活[18]。多囊卵巢綜合征(PCOS)伴肥胖、體重超重的患者，多伴有高胰島素血癥、胰島素抵抗，二甲雙胍通過提高其胰島素敏感性具有輔助治療作用。二甲雙胍可通過調節糖酵解途徑改善PCOS患者的排卵障礙[19]。此外，二甲雙胍還可以通過抑制氧化應激調節PCOS患者的激素水平[20]。本研究結果表明，二甲雙胍可顯著改善H2O2導致的睪丸間質細胞功能受損，主要表現為細胞存活率的升高，睪酮含量增加，睪酮合成酶的表達上調。此外，本研究還表明，二甲雙胍可顯著抑制氧化應激和細胞凋亡，表現為SOD和CAT活性的增加，MDA含量的降低，凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3表達降低。

本研究還存在一定局限性。首先，我們并沒有在動物水平驗證二甲雙胍改善睪丸間質細胞功能的作用；其次，未對二甲雙胍改善睪丸間質細胞功能的具體機制進行探討，這些問題值得后續進一步探索。

綜上，本研究揭示了二甲雙胍對H2O2介導的睪丸間質細胞損傷具有重要的保護作用，深化了間質細胞功能障礙在男性不育中的認識，為間質細胞功能障礙導致的男性不育的臨床治療提供了新的思路。