踝節菌屬真菌Talaromyces wortmannii LGT-4化學成分及生物活性研究

張旭東，李嘯飛，楊中鐸

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730050）

近年來，天然產物已成為尋求高生物活性物質和新藥前體的主要路徑，天然產物作為藥物的主要來源，種類豐富，數量龐大，毒副作用小。植物內生真菌不僅能夠參與植物次生代謝產物的合成以及對植物次生代謝產物進行轉化，還能獨立產生豐富的次生代謝產物，是天然產物的重要來源，是一類具有高度開發價值的新型生物資源，對其的研究已經成為微生物學研究的一大熱點。

雷公藤（Tripterygium wilfordii）為衛矛科雷公藤屬植物，是傳統的中藥材，性苦、寒，具有清熱解毒、祛風通絡、舒筋活血等功效，用于治療類風濕性關節炎、腎炎、紅斑狼瘡、血小板減少性紫癜等［1］。經過長期的研究發現，植物內生真菌可以產生與宿主相似甚至相同的次級代謝產物，其中包括抗腫瘤、抗炎、抗菌等多方面的天然產物。目前已經有多種藥用植物的代謝產物應用于臨床，在醫藥領域發揮著舉足輕重的作用。

本課題組從雷公藤中分離得到了一株踝節菌屬內生真菌，經分子生物學鑒定為踝節菌屬（Talaro?myces）Talaromyces wortmannii，又名籃狀菌，是青霉菌屬（Penicillium）的一個亞屬。該屬真菌能代謝出豐富的新次級代謝產物，包括生物堿、多肽、內酯、聚酮等類化合物。其中，生物堿（Alkaloid）是廣泛存在于自然界中的一類含氮的堿性化合物，有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一［2］；酯類（Esters）化合物是踝節菌屬真菌的最主要次級代謝產物［3］；聚酮（Polyketides）是一類由細菌、真菌、植物與動物所生產出來的次級代謝產物，可用于抵抗病蟲害［4］。在抗生素、細胞穩定（Cytostatic）和天然殺蟲劑等領域具有極高的價值；多肽主要控制人體的生長、發育、免疫調節和新陳代謝［5］。前期研究表明，該菌株能產生許多新化合物如Secovironolide、Epoxyvirone［6］和 Wortmannolol［7］。 為 了 進 一 步 從 該菌株中獲得結構新穎、具有一定藥理活性的化合物，本研究對Talaromyces wortmanniiLGT-4 的改良馬丁氏培養基發酵產物的化學成分和生物活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及材料 踝節菌屬真菌Talaromyces wortmanniiLGT-4（GenBank 收錄號：KF850714）為本課題組前期從藥用植物雷公藤根中分離得到的一株植物內生真菌，該菌株現保存于蘭州理工大學生命科學與工程學院。

1.1.2 培養基 改良馬丁氏培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸氫二鉀1 g，酵母浸出粉2 g，硫酸鎂0.5 g，去離子水1 L。

1.1.3 儀器 600 MHz 液體超導核磁共振波譜儀；雙泵雙波長高效液相色譜；Bruker Daltonics APEXⅡ47e質譜儀；BioTek 酶標儀 Elx808；96 孔酶標板。

1.2 方法

1.2.1 次級代謝產物的提取分離方法 將活化好的Talaromyces wortmanniiLGT-4 接 入 50 L 發 酵 罐 中 發酵25 d。發酵結束后，將菌絲與菌液分離，用乙酸乙酯對菌液等體積萃取，共得到Talaromyces wortman?niiLGT-4 改良馬丁氏培養基發酵產物浸膏10 g。經大孔吸附樹脂分離，乙醇-水梯度洗脫（10%、30%、50%、70%、90%），得到4 個組分，分別為G-A（1.5 g）、G-B（3.0 g）、G-C（2.5 g）、G-D（1.5 g）。

G-A 組分用硅膠柱層析，二氯甲烷∶甲醇（30∶1、20∶1、8∶1、5∶1、2∶1）梯度洗脫，得到4 個組分：G-AA、G-A-B、G-A-C、G-A-D。G-A-C（300 mg）用高效液相色譜（流速1.2 mL/min，流動相53%的甲醇水，tR=18 min）分離得到化合物 9（2 mg），G-A-D（390 mg）用高效液相色譜（流速0.8 mL/min，流動相32%的甲醇水，tR=21min）分離得到化合物4（1.8 mg）。

G-B組分用MCI柱層析，甲醇水（20%、30%、40%、50%、60%、100%）梯度洗脫，得到5 個組分：G-B-A、G-B-B、G-B-C、G-B-D、G-B-E。G-B-C（800 mg）用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（50∶1、30∶1、10∶1、8∶1、5∶1）梯度洗脫，得到 3 個組分 G-B-C-A、G-B-C-B和G-B-C-C。其中G-B-C-B 組分（92 mg）用高效液相色譜（流速1.5 mL/min，流動相62%的甲醇水，tR=25.2 min）分離，得到化合物 7（20 mg），G-B-D 選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1）梯度洗脫，得到4 個組分G-B-D-A、G-B-D-B、G-B-D-C和G-B-D-D。其中G-B-D-B組分（40 mg）用高效液相色譜（流速1.2 mL/min，流動相66%的甲醇水，tR=44.8min）分離，得到化合物5（1.2 mg）。

G-C組分用MCI柱層析，甲醇水（20%、40%、50%、60%、80%、100%）梯度洗脫，得到5 個組分：G-C-A、G-C-B、G-C-C、G-C-D、G-C-E。G-C-B（560 mg）選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（30∶1、20∶1、10∶1、5∶1）梯度洗脫，得到 G-C-B-A、G-C-B-B。G-CB-A（60 mg）使用高效液相色譜（流速1.2 mL/min，流動相47%的甲醇水，tR=46.6 min）分離，得到化合物2（3 mg）。G-C-B-B（70 mg）用高效液相色譜（流速0.8 mL/min，流動相 27%的乙腈水，tR=18.1 min）分離，得到化合物6（2 mg）。G-C-C（630 mg）選用硅膠柱層析，二氯甲烷∶丙酮（30∶1、20∶1、15∶1、6∶1、3∶1）梯度洗脫，得到組分G-C-C-C（72 mg），使用葡聚糖凝膠LH-20 分離，用氯仿甲醇1∶1 洗脫，得到化合物3（10 mg）。G-C-D（320 mg）選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（100∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1）梯度洗脫，得到 2 個組分G-C-D-A 和G-C-D-B。其中G-CD-A 組分（45 mg）用高效液相色譜（流速0.8 mL/min，流動相47%的甲醇水，tR=23min）分離，得到化合物1（1.6 mg）。

G-D 組分選用MCI 柱層析，甲醇水（40%、50%、60%、70%、80%、100%）梯度洗脫，得到3 個組分：GD-A、G-D-B、G-D-C。G-D-A（200 mg）選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（120∶1、80∶1、30∶1、20∶1、10∶1）梯度洗脫，得到化合物10（12 mg）。G-D-B（250 mg）選用硅膠柱層析，石油醚∶丙酮（60∶1、35∶1、30∶1、20∶1、10∶1）梯度洗脫，得到化合物8（30 mg）。

1.2.2 次級代謝產物的生物活性測定

1）乙酰膽堿酯酶抑制活性測定。采用改進的Ellman 法（酶標法）對分離出的化合物進行乙酰膽堿酯酶抑制活性評價，測定方法同文獻［8］。其樣品終濃度均為30 μg/mL，用石杉堿甲作為陽性藥。

2）磷脂酰肌醇3-激酶抑制活性測定。采用體外激酶檢測試劑盒的方法測定了樣品的PI3K 抑制活性，通過檢測磷脂酰肌醇3-激酶反應后生成ADP的量來確定化合物的抑制率，測定方法同文獻［9］。樣品終濃度均為0.2 μg/mL，陽性藥為GDC-0941。

1.3 化合物結構鑒定

從踝節菌屬真菌Talaromyces wortmanniiLGT-4改良馬丁氏培養基發酵產物中分離得到10 種化合物，運用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS 等現代波譜技術，結合文獻比對，對分離的10 個化合物進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 化合物鑒定結果

從踝節菌屬真菌Talaromyces wortmanniiLGT-4改良馬丁氏培養基發酵產物中分離得到10 種化合物，結合文獻比對，對分離的10 個化合物進行了鑒定。分別鑒定為Cyclo-（Pro-Ile）（1）、Cyclo（L-Tyr-L-Leu）（2）、Cyclo-（L-Pro-L-Phe）（3）、Aspergillu?marin B（4）、Deacetylisowortmin（5）、Chaetominine（6）、（E）-2-（hydroxymethyl）-3-（2-hydroxypent-3-enyl）phenol（7）、N-（2-Phenylethyl）acetamide（8）、4-hydroxynaphthalide（9）、1，2-Benzenedicarboxylic acid，dibuty ester（10）。

2.2 乙酰膽堿酯酶抑制活性

采用Ellman 法對10 個單體化合物的抗AChE 活性進行了測定，結果見表1。單體化合物的初濃度為300 μg/mL（終濃度為30 μg/mL），陽性藥石杉堿甲的IC50=（0.31±0.12）μg/mL。化合物1 表現出較好的抗乙酰膽堿酯酶的活性，IC50為11.76 μg/mL。

2.3 磷脂酰肌醇3-激酶抑制活性

采用體外激酶檢測試劑盒的方法，對10個單體化合物的抗PI3K 活性進行了測定，結果見表2。單體化合物的初濃度為20 μg/mL（終濃度為0.2 μg/mL），陽性藥GDC-0941的IC50為（4.5±0.2）nmol/L。結果表明化合物均沒有很好的抗磷脂酰肌醇3-激酶活性。

3 小結與討論

研究從Talaromyces wortmanniiLGT-4 改良馬丁氏培養基發酵產物中分離得到10 個單體化合物，其中化合物 1、2、3、6、8 為首次從該真菌中分離得到。采用酶標法及激酶檢測試劑盒的方法，對10 個單體化合物進行了抗乙酰膽堿酯酶、抗磷脂酰肌醇3-激酶的活性測定。結果表明，化合物1 具有較好的抗乙酰膽堿酯酶的活性，IC50為11.76 μg/mL。化合物的抗磷脂酰肌醇3-激酶活性均比較弱。到目前為止，未見對本研究中分離化合物的抗乙酰膽堿酯酶和抗磷脂酰肌醇3-激酶活性的報道。

表1 10 種化合物抗乙酰膽堿酯酶活性

表2 10 種化合物抗磷脂酰肌醇3-激酶抑制活性

Chen 等［10］研 究 發 現 ，N-（2-Phenylethyl）acet?amide（8）具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制作用，其IC50為（75.87±4.86）μmol/L，同時還具有抗hepG2 細胞增殖的作用，其IC50為（133.56±10.69）μmol/L。Ji?ao 等［11］從沙參內生真菌Chaetomiumsp. IFBE015 中分離得到Chaetominine（6），發現Chaetominine（6）相比于5-氟尿嘧啶具有更好的人類白血病K562 細胞和結腸癌 SW1116 細胞毒性，表明 Chaetominine（6）具有成為抗癌藥物的潛力。本研究首次報道了化合物7 的抗乙酰膽堿酯酶活性，由于乙酰膽堿酯酶抑制劑常用于阿爾茨海默癥的治療，因此化合物7 可能具有抗阿爾茨海默癥作用，有待于進一步研究。