生物轉化法提高木糖醇產量的發酵條件優化

陳雪松，楊勝利

(1.浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310015；2.浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

傳統木糖醇生產工藝是以玉米芯為原料，經過酸水解等預處理，產生木糖，采用加氫催化技術制備木糖醇。該工藝產量較低，能耗大，污染嚴重且生產成本高。此外，鎳催化劑會污染環境，嚴重制約企業發展和國際競爭力。而采用微生物發酵半纖維素水解液生產木糖醇，具有反應條件溫和、低能耗、相對環境污染程度小、產品質量安全可靠的優點[1-5]。

柑橘皮渣尚未得到好的開發利用，基本上任其腐爛，化為塵土肥料。也曾有人從柑橘皮渣提取精油、果膠、色素、黃酮、檸檬苦素和膳食纖維等，但都未形成規模生產。柑橘皮渣富含半纖維素，用其做原料生產木糖乃至木糖醇，成本低廉，目前國內外未見相關報道。并且柑橘皮渣中的木聚糖結合不如玉米芯牢固，容易水解得到木糖。本研究以實驗室保藏的轉化木糖醇的Y-3號菌株為實驗菌株，對木糖轉化發酵條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種來自實驗室保藏的Y-3號菌株。

活化培養基：酵母膏5 g·L-1，磷酸二氫鉀2 g·L-1，D-木糖20 g·L-1，二水氯化鈣0.1 g·L-1，硫酸銨5 g·L-1，七水硫酸鎂0.2 g·L-1，瓊脂20 g·L-1。

種子保藏培養基：酵母膏5 g·L-1，磷酸二氫鉀2 g·L-1，D-木糖20 g·L-1，二水氯化鈣0.1 g·L-1，硫酸銨5 g·L-1，七水硫酸鎂0.2 g·L-1，瓊脂20 g·L-1。

發酵培養基：柑橘皮水解液(木糖含量20 g·L-1)，酵母粉10 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1。

滅菌條件：木糖與其他營養成分分開滅菌，條件為121 ℃，20 min。

1.2 方法

1.2.1 柑橘皮水解液的制備

柑橘皮選自溫州蜜柑皮，將蜜柑皮烘干后，用電動粉碎器粉碎，粉碎粒度100目，半纖維素質量分數為6.9%。

柑橘皮半纖維素水解。柑橘皮粉末以1∶7(質量∶體積)的固液比與質量濃度1.0%硫酸混合，121 ℃下水解1 h。

濃縮。水解液離心濾去殘渣后，50 ℃真空濃縮，至總還原糖約為20%。

中和。水解液用NaOH中和至pH 10.0，4 000 r·min-1離心20 min去除沉淀。上清液用濃硫酸回調至pH 5.5，冷藏備用。

1.2.2 發酵條件的優化

發酵條件的優化，具體是對裝液量、接種量、水解液的pH、發酵溫度、轉速進行單因素實驗，依次求得最優培養條件。發酵實驗每個變量做3個平行樣，以木糖轉化率為指標，確定最優條件。

1.2.3 測定方法

取待測樣品10 mL，3 000 r·min-1離心10 min，將上清液適當稀釋。在25 mL大試管中加入1 mL稀釋的上清液和3 mL的DNS試劑，充分混合，沸水浴中反應5 min，冷卻，定容至25 mL。在波長540 nm處測量吸光度值，根據標準曲線回歸方程計算出樣品木糖濃度[6]。

使用紫外分光光度計法測定木糖醇的含量[7]。取適量發酵液，4 500 r·min-1離心15 min，將上清液適當稀釋。取1 mL稀釋液于小試管中，加入1 mL試劑a，混勻后在室溫下反應10 min，再分別加入2 mL試劑b和4 mL的NaSH試劑，混合均勻后在53 ℃水浴中保溫15 min，冷卻后于412 nm處測定吸光度值。試劑a：將0.320 g高碘酸鉀溶于100 mL 1%的鹽酸中；試劑b：配置鼠李糖1.11 g·L-1；NaSH試劑(需現配現用)：在100 mL 150 g·L-1的乙酸銨中，分別加入0.2 mL的乙酸及乙酰丙酮。

2 結果與分析

2.1 木糖的標準曲線

木糖的標準曲線見圖1。

圖1 木糖的標準曲線

2.2 木糖醇的標準曲線

木糖醇的標準曲線見圖2。

圖2 木糖醇的標準曲線

2.3 發酵條件的優化

2.3.1 轉速對發酵效果的影響

木糖及木糖醇轉化率的影響因素比較多，其中溶解氧是關鍵其一[8]，菌體生長和代謝產物的積累取決于溶解氧的多少。通常發酵液溶氧量的改變是通過調節轉速來實現的。對木糖醇產生的代謝網絡分析看出，在木糖還原酶(XR)的催化作用下，以NADPH為輔酶轉化產生木糖醇，此過程不需要氧的參與。而代謝過程在需氧狀態下[9]，木糖醇會進一步在木糖醇脫氫酶(XDH)的催化下氧化生成木酮糖，更多的文獻表明微耗氧環境對木糖醇的積累是有利的。因而，實驗設置了100、120、140、160和180 r·min-1的低轉速，以研究其生物轉化木糖醇情況(表1)。

表1 搖床轉速對發酵效果的影響

由表1可知，隨著轉速不斷增大，酵母菌轉化木糖醇的量也隨之增加，但是幅度并不明顯，在轉速為140 r·min-1時，木糖轉化率最高為54.4%。再增大轉速影響不大，主要原因是增大轉速使得溶解氧量增加，在發酵前期更加有利于酵母菌的繁殖。因此，當轉速為140 r·min-1時已經能夠滿足溶氧要求，達到酵母生長的目的。

2.3.2 裝液量對發酵效果的影響

搖瓶發酵過程中裝液量的控制非常關鍵。在轉速不變的情況下，搖瓶裝液量決定了水解液溶解氧的濃度[10]。模擬好氧、缺氧以及厭氧條件的表征是通過裝液量來實現的。影響發酵反應產物積累的重要條件是曝氣量，通常氧氣充分的狀態下不會產生木糖醇，在嚴格厭氧的狀態下菌體不能利用木糖進行發酵。

在250 mL的錐形瓶里，實驗設置了20、40、60、80 mL的裝液量，研究其發酵情況(表2)。

表2 裝液量對發酵效果的影響

由表2可知，在裝液量為40～60 mL時發酵效果最好，木糖轉化率超過55%。此時酵母菌發酵所需營養物質充足，體系傳質效果好，且提供了足夠的溶氧和養分供酵母菌進行繁殖。

2.3.3 溫度對發酵效果的影響

溫度對微生物生長繁殖和代謝產物積累是至關重要的，溫度通過對菌種體內酶的改變來影響微生物的發酵狀態。偏低或者偏高的溫度會影響代謝產物的積累，是由于溫度會影響菌體內酶活性、氧氣和其他營養物質的傳質速率。在最適溫度情況下，有利于菌種體內酶的生長、發酵和轉化，并處于最佳活性狀態。偏離這個溫度，過低會使酶的活性降低，過高可能導致酶變性失活。因而基于酵母菌生長及代謝產物積累的特性，實驗設置了25、30、35、40 ℃ 4個溫度變量，以研究其木糖醇轉化情況。

由表3可知，隨著溫度升高，酵母菌所產生的木糖醇也隨之增加，在30 ℃達到最大的木糖轉化率57.7%，超過35 ℃時轉化率反而下降，達到40 ℃時轉化率很低，只有42.4%，這可能與菌體內參與代謝的酶活性受溫度影響有關。

表3 溫度對發酵效果的影響

2.3.4 接種量對發酵效果的影響

接種量是指投加種子液的體積和接種后培養液體積的比值。菌種在發酵液中生長繁殖的速度由接種量的多少決定，增加接種量可以縮短發酵中菌絲繁殖達到高峰的時間，提前形成產物，并能大大削弱雜菌的生長機會。但投加的接種量過多或者過少，都會對發酵產生影響。對于接種量的優化，主要考慮菌體與營養物質及代謝產物的關系，接種量過少延長發酵時間，降低發酵罐的生產率。過多則會消耗過多底物用于菌體生長，并且可能引起溶氧不足，過多移入代謝廢物，對木糖醇積累不利，且成本過高[11]。適宜的接種量，菌體在發酵液中生長旺盛，同時營養成分不會過分消耗，能夠正常累積代謝產物。因此，實驗設置了4%、6%、8%、10% 4個接種量變量，以研究其木糖醇轉化情況。

由表4可知，木糖醇的轉化率受接種量影響也較大，隨著接種量的增大，在6%的接種量木糖轉化率達到最大值61.5%，再增加接種量木糖轉化率反而降低，可能是由于菌體的增多導致其代謝廢物積累也多，影響發酵。

表4 菌體接種量對發酵效果的影響

2.3.5 起始pH對發酵效果的影響

pH在菌體發酵過程中，影響著菌體的生長繁殖和代謝途徑，適宜的pH范圍能促進微生物代謝產物的積累，是菌體新陳代謝活動的重要影響因素。各種菌種在轉化木糖醇時最佳pH值不同，本實驗選用的Y-3菌種在pH呈酸性條件下生長繁殖非常旺盛。很多研究者報道酵母轉化木糖產生木糖醇的最適宜pH為4.0～6.0[12]。因此，本實驗設置了4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 pH變量，以研究其木糖醇轉化情況。當pH為4～6時菌株具備了木糖醇轉化能力，并具有一定的正相關性，其中在pH為5.5時有最高的轉化率，達到64.4%(表5)。

表5 起始pH對發酵效果的影響

3 小結

產木糖醇Y-3號菌株的優化發酵條件：轉速140 r·min-1，裝液量為60 mL，適宜溫度30 ℃，最佳接種量為6%，起始pH 5.5。優化后實驗測得木糖醇濃度為11.5 mg·mL-1，木糖轉化率為64.4%，較未優化時的木糖轉化率提高。