紫莖澤蘭栽培平菇的毒理學研究

朱建義，楊潔淼，趙浩宇，劉勝男，黃靜，周小剛*

(1.四川省農業科學院 植物保護研究所，四川 成都 610066；2.農業部西南作物有害生物綜合治理重點試驗室，四川 成都 610066；3.金堂縣農業產業發展服務中心，四川 金堂 610400)

隨著食用菌產業的大力發展，食用菌栽培原料面臨資源短缺、價格高漲等問題，尋找新型培養基質迫在眉睫[1]。平菇是我國栽培量和消費量最大的食用菌之一，隨著平菇生產規模逐年擴大，培養基質日趨緊張，新型培養基質的研究相繼開展，范圍涵蓋果實、中藥材、木材、菌糠或菌渣、外來植物等[2]。陳若霞等[3]利用加拿大一枝黃花，周浩等[4]以大米草作為主料栽培平菇，陳謙等[5]研究了紫莖澤蘭對平菇產量及營養成分的影響。紫莖澤蘭(EupatoriumadenophorumSpreng)是一種入侵性惡性雜草，其營養豐富，是生產食用菌的優質原料[6-7]。利用其栽培食用菌，一方面為食用菌生產提供成本低廉、原料豐富的培養料，同時又可有效控制雜草危害，具有較好的生態、經濟和社會效益。紫莖澤蘭是一種含有有毒物質的有害雜草[8]，利用其栽培平菇是否存在毒性殘留和富集的安全性問題，目前鮮有報道。明確利用紫莖澤蘭栽培平菇的安全性，可為新型基質紫莖澤蘭的系統研究提供參考和依據。本研究使用紫莖澤蘭栽培平菇，并進行毒理學研究，以明確其是否具有安全隱患。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及菌種

紫莖澤蘭采自四川省西昌市；平菇雜優1號，由四川省農業科學院土壤肥料研究所提供；昆明種小白鼠，體重18～22 g，由山東大學試驗動物中心提供[試驗動物許可證號：SCXK(魯)20130009號]。

1.1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g, 水1 000 mL。

常規平菇培養基：玉米芯70%，稻草10%，米糠10%，玉米粉7%，尿素0.5%，磷粉1%，石膏1.5%。

紫莖澤蘭平菇培養基：紫莖澤蘭42%，玉米芯28%，稻草10%，米糠10%，玉米粉7%，尿素0.5%，磷粉1%，石膏1.5%。

1.2 方法

1.2.1 紫莖澤蘭前處理及栽培基質配制

取曬干的紫莖澤蘭莖稈，粉碎成長度約5 mm的秸稈粉。先將紫莖澤蘭秸稈粉、玉米芯用1∶500倍克霉靈溶液3～4 h濕透后，撈出與其他原料按比例混合均勻，再加水拌勻，料水質量比為1∶1.2～1.4，石灰先溶于水后取上清液加入，使pH達7.5～8.5。混勻，建堆，蓋膜，待料溫升至55 ℃時進行翻堆，一般情況翻堆1～2次即可，堆漚時間以15 d為宜。

1.2.2 出菇試驗

按上述方法將栽培基質配制好后，裝袋，套上頸圈，包扎袋口，100 ℃滅菌36 h，冷卻后在無菌條件下接種平菇菌種。然后將菌袋置于培養室內，溫度25～27 ℃，相對濕度85%。待菌絲長滿菌袋，增加通風，控制溫度18～20 ℃，打開袋口待子實體生長成熟時采集子實體。

1.2.3 毒理學試驗

毒理學研究委托山東省職業衛生與職業病防治研究院進行。分別采集紫莖澤蘭平菇(以下簡稱澤蘭平菇)和普通平菇子實體，曬干或烘干后各取干品2 kg，進行小鼠經口急性毒性試驗、小鼠30 d喂養試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核計數和小鼠精子畸形試驗。

將澤蘭平菇加工成粉末狀，配成所需濃度。按照GB 15193.3—2003，采用最大限量法進行急性毒性試驗方法。選健康小鼠20只，其中雌雄各10只。動物禁食12 h后稱重分2次灌胃，灌胃體積按0.2 mL·kg-1體重計算，間隔6 h，劑量為15 000 mg·kg-1。動物給予受試物后連續觀察14 d，記錄動物中毒癥狀及死亡情況，最后根據動物死亡數量求出半數致死量(LD50)。

選健康小鼠50只，雌雄各半，適應性飼養3 d后，隨機分為5組，每組10只：大劑量組(10 g·kg-1組)、中劑量組(5 g·kg-1組)、小劑量組(2.5 g·kg-1組)、普通平菇組(10 g·kg-1)及對照組。試驗前將平菇粉摻入飼料中，加工成10%、5%、2.5%澤蘭平菇小鼠飼料及10%普通平菇小鼠飼料，大劑量組給予10%澤蘭平菇小鼠飼料，中劑量組給予5%澤蘭平菇小鼠飼料，小劑量組給予2.5%澤蘭平菇小鼠飼料，普通平菇組給予10%普通平菇小鼠飼料，對照組給予正常小鼠飼料，試驗動物連續喂養30 d。動物喂養在SPF級動物房內進行。

試驗期間每天觀察記錄小鼠的活動、進食情況及中毒癥狀，每周稱量小鼠體重。試驗結束時各組小鼠均采用摘眼球取血測定血液中白細胞總數(WBC)及分類(NEU、LYM)、紅細胞總數(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血小板計數(PLT)、血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的含量。并對全部動物進行解剖，檢查腦、心、肺、肝、脾、腎、胃、腎上腺、睪丸、子宮等臟器情況，記錄所見異常變化。取腦、心、肝、脾、肺、腎、睪丸、腎上腺等主要臟器稱重，計算臟器系數(臟器重/體重×100%)。每組留取6只小鼠的主要臟器標本，用10%甲醛固定后，進行病理形態學檢查。

選健康小鼠50只，雌雄各半，適應性飼養3 d后，隨機分為5組，每組10只：澤蘭平菇大劑量組、中劑量組、小劑量組及陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組給予純凈水，陽性對照組給予40 mg·kg-1環磷酰胺腹腔注射。試驗動物每日經口給藥1次，連續2 d，于第2天給藥后6 h處死動物，取兩側股骨骨髓，常規制片，Giemsa染色，鏡下觀察，每只動物觀察10 000個嗜多染紅細胞，求出微核率。

選健康雄性小鼠50只，隨機分成5組，每組10只，試驗處理及給藥同上。給藥后5 d脫臼處死動物，取出的雙側附睪置于盛有2 mL生理鹽水的小燒杯中剪碎，4層擦鏡紙過濾后制成精子懸液，進行精子計數、精子存活數和精子畸形檢查。精子計數：取已制備好的精子懸液1滴灌入血細胞計數板的計數池中，高倍顯微鏡下計數池中5個中方格中的精子數，換算成1 mL精子懸液中的精子數即為每側附睪的精子數量。精子畸形率：取已制備好的精子懸液以1 000 r·min-1離心5 min，吸去上清液，剩余少量液體與沉淀搖勻后，取懸液1滴置于潔凈載玻片一側，推片，晾干后甲醇固定5 min，干后用2%伊紅水溶液染色1 h，在高倍顯微鏡下檢查精子形態，每只鼠檢查完整精子1 000個，計算畸形率。

1.3 數據分析

利用Excel 2010和DPS 7.05進行數據整理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 小鼠經口急性毒性

小鼠經口給予15 000 mg·kg-1澤蘭平菇后，動物出現靜臥，飲食活動減少，8 h后逐漸恢復正常。連續觀察14 d動物無死亡(表1)。結果表明，雌雄性小鼠經口急性毒性LD50>15 000 mg·kg-1，按照GB 15193.3—2003，澤蘭平菇屬無毒物質。

表1 不同小鼠性別的經口急性毒性

2.2 小鼠30 d喂養

試驗各組血常規、血生化及臟器系數檢查均未見異常(表3～5)。澤蘭平菇大劑量組及普通平菇組小鼠喂養2周后被毛蓬松，體重增長緩慢，與對照組相比有顯著性差異(表2)；小鼠解剖觀察可見胃內容物較少，且呈黏液狀；病理組織學檢查胃黏膜細胞萎縮，黏膜層輕度變薄，炎細胞輕度增多，但未累及黏膜肌層。未見澤蘭平菇有明顯的毒性作用。

表2 不同級別小鼠喂養30 d的體重情況

表3 不同級別小鼠喂養30 d的血常規

表4 不同級別小鼠喂養30 d的血生化指標

表5 不同級別小鼠喂養30 d的臟器系數

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核計數

澤蘭平菇各組微核率為0.17%～0.19%，陰性對照組為0.18%，澤蘭平菇各組與陰性對照組均無顯著性差異。而陽性對照組為1.94%，與陰性對照組相比有極顯著差異(表6)。結果表明，在本試驗條件下，澤蘭平菇對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率無明顯影響。

表6 紫莖澤蘭對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響

2.4 小鼠精子畸形率

澤蘭平菇各組精子計數、精子存活率、精子畸形率與陰性對照組比較，均無顯著性差異，而陽性對照組與陰性對照組相比有顯著性差異(表7)。結果表明，在本試驗條件下，澤蘭平菇對小鼠精子畸形率無明顯影響。

表7 紫莖澤蘭對小鼠精子的影響

3 小結與結論

紫莖澤蘭是一種含有毒物質的有害雜草，其主要有毒成分是佩蘭毒素、澤蘭苦內脂、香豆精類、丹寧等[8]。可引起大鼠肝臟毒性及血生化的改變[9-10]。紫莖澤蘭醇提取物有一定胚胎毒性[11]。因此，利用紫莖澤蘭栽培食用菌的食品安全性問題就顯得至關重要。本研究結果顯示，小鼠經口急性毒性LD50雌雄性動物均>15 000 mg·kg-1，按照GB 15193.3—2003進行急性毒性試驗，澤蘭平菇屬無毒物質；小鼠30 d喂養試驗各組血常規、血生化及臟器系數檢查均未見異常；小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核和小鼠精子畸形試驗結果均為陰性，表明澤蘭平菇無致突變致畸作用。其原因可能是通過紫莖澤蘭前處理、高溫滅菌以及平菇自身含有的大量生物酶，將紫莖澤蘭有毒物質降解，參與平菇生長的代謝過程，但其解毒機理有待深入研究。