不同病態竇房結綜合征造模方法對SAN結構、功能的影響

畢路甲，付升旗

摘要：目的：不同病態竇房結綜合征造模方法對竇房結（SAN） 解剖位置、組織細胞形態學及起搏相關離子通道功能的影響。方法：將36只兔隨機分成假手術組、甲醛濕敷組和甲醛滴注組，每組12只。甲醛濕敷組兔采用甲醛濕敷法進行建模;甲醛滴注組兔采用甲醛滴注法進行建模;假手術組僅打開胸腔，剪開心包膜，不進行甲醛濕敷或甲醛滴注。HE染色觀察SAN組織形態變化。采用心房調搏法測量造模前及造模后1 h的竇房傳導時間（SACT） 、竇房結恢復時間（SNRT） 、校正竇房結恢復時間（SNRTc） 。采用心房調搏法測量造模前及造模后1 h的竇房傳導時間（SACT） 、竇房結恢復時間（SNRT） 、校正竇房結恢復時間（SNRTc） 。Western blot檢測SAN組織超極化激活環核苷酸門控非選擇性陽離子通道（HCN4） 蛋白。結果：甲醛濕敷組和甲醛滴注組組織細胞形態學差異不明顯（P > 0.05） 。甲醛滴注組SNRT、SNRTc和SACT高于甲醛濕敷組（P < 0.05） 。甲醛滴注組HCN4 mRNA和蛋白表達低于甲醛濕敷組（P < 0.05）。結論：甲醛濕敷法建立兔SAN損傷模型優于甲醛滴注法。

關鍵詞：病態竇房綜合征;竇房結;組織細胞形態學;離子通道

竇房結（SAN） 是各種哺乳動物心臟右心房上的一個特殊的小結節，能啟動和調控心臟節律。病態竇房結綜合征簡稱病竇綜合征或病竇，又稱竇房結功能障礙，是由竇房結病變而引起的一組由癥狀組成的心血管疾病[1～2]。對于明確診斷為病態竇房結綜合征患者，無論是內科保守治療還是外科手術介入治療，臨床患者都會受到一系列并發癥的威脅，嚴重者可發生阿斯綜合征導致暈厥，甚至猝死[3]。在探討病態竇房結綜合征治療方法過程中，一個重要的研究手段是在動物身上復制SAN功能損傷模型。目前多采用手術方法或者藥物方法建立竇房結功能損傷模型，然而對某一個體動物模型不同方式的建立對SAN以及起搏相關離子通道功能的影響尚無研究報道。本文采用甲醛濕敷法和甲醛滴注法對兔進行SAN損傷建模，比較兩種不同建模方式對SAN組織細胞形態學及起搏相關離子通道功能的影響。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗主要儀器和試劑

甲醛購自國藥集團化學試劑有限公司;超級化激活的環核苷酸陽離子通道（HCN1） 、HCN2、HCN3、HCN4抗體以及相應的二抗購于Santa Cruz公司;RNA提取試劑TRIzol及轉染試劑Lipofectamine 2000均購自武漢極捷生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液及BCA法蛋白濃度測定試劑盒購自金克隆（北京） 生物技術有限公司;ECL發光液購自北京伊塔生物科技有限公司;光學顯微鏡購于北京安麥格貿易有限公司;烏拉坦購自國藥集團化學試劑有限公司;B203LED 型生物顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司） ;DF-5A 型心臟電生理刺激儀（蘇州市東方電子儀器廠） ;BL420S 生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司） 。

1.2 實驗動物

普通級兔36只，雌雄各半，體重2.02～3.58 kg，購于吉林和元生物工程股份有限公司;許可證號：SYXK（吉） 2021-0004。將普通級兔隨機分成甲醛濕敷組、甲醛滴注組和假手術組，每組12只。所有家兔適應性喂養1周后進行造模。甲醛濕敷組兔采用甲醛濕敷法進行建模，甲醛滴注組兔采用甲醛滴注法進行建模。假手術組所有兔僅打開胸腔，剪開心包膜，不進行甲醛濕敷或甲醛滴注。在整個實驗過程中對動物的處置均符合醫學倫理學標準。

1.3 實驗方法

1.3.1 病態竇房綜合征模型建立

所有兔經耳緣靜脈注射 20 % 烏拉坦 4 ～5 mL/ kg 麻醉后固定，連接體表心臟Ⅱ導。第三肋骨水平為中心備皮、消毒后沿胸骨正中偏右 2 ～3 mm 縱行切開胸腔，暴露右心房，用注射器連接套管，深入心包膜腔內側，輕輕吸取心包液。

濕敷法：用干棉簽輕放于右心耳處，輕輕將心臟撥向左側，暴露右心房與上腔靜脈交界（SAN區） ，用40 %甲醛將棉簽底部充分浸潤，輕輕送至SAN區，濕敷3～5 min。當心率較濕敷前下降 30 %以上或出現竇性停搏、竇房阻滯或結性逸搏時取出棉簽，觀察心律變化情況。對未出現上述心律失常者則持續濕敷，并繼續觀察心律情況。

滴注法：將自制標測電極一端連接于心臟V1導聯，另一端放置于竇房結區，標測竇房結電圖，并固定位置，然后將自制標測電極末端接上裝有40 %甲醛的微量注射器，彈丸樣緩慢推注。當心率下降30 %以上或出現竇性停搏、竇房阻滯或結性逸搏時暫停推注，觀察心律變化情況。對未出現上述心律失常者則持續推注，最大量至0. 03 mL。

1.3.2 SAN組織形態觀察

按在建模1周后對兔進行麻醉、開胸、暴露心臟，去SAN組織制備標本。將切取的竇房結組織經生理鹽水沖洗干凈后立即置入4 %多聚甲醛固定，常規脫水、透明、石蠟包埋及HE染色，在光鏡下觀察竇房結細胞形態結構的改變。

1.3.3 檢測SAN功能指標

采用心房調搏法測量造模前及造模后1 h的竇房傳導時間（SACT） 、竇房結恢復時間（SNRT） 、校正竇房結恢復時間（SNRTc） 。比較各組模型兔造模前后SACT、SNRT和SNRTc。

（1） 實時熒光定量檢測（RT-PCR） 檢測HCN1、HCN2、HCN3、HCN4 mRNA表達：采用Trizol法提取SAN組織中的總RNA，采用紫外分光光度計法測定RNA的濃度。以RNA為模板進行逆轉錄獲得cDNA并置于4℃保存，進行熒光定量PCR擴增，置于RT-PCR儀（CFX96型，美國bio-radBiorad公司） 中進行測定。設置反應條件：95 ℃，5 min預變性;95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火35 s，65 ℃延伸 30 s，擴增35個循環。以β-action為內參，引物序列如下：HCN1：上游序列：5′-TGGTGGCTACAATGCCTTTA-3′，下游序列：5′-TTCCTCCGGGACCTCGTT-3′ ;HCN2：上游序列：5′-CGTTACCAGGGCAAGATGTTT-3′，下游序列：5′-GTTGTCCACGATCAGCGAAT-3′;HCN3：上游序列：5′-TCTCCGACACCTTCT。TTCTGC-3′，下游序列：5′-CCCACTGGTGTATGTAGCGG-3′;HCN4：上游序列：5′-GTACTCCTACGCGCTCTTCA-3′，下游序列：5′-GCTCTCCTCGTCGAACATCT-3′;β-action：上游序列： 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游序列：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。采用 2-ΔΔCT 法對統計HCN1、HCN2、HCN3、HCN4 mRNA相對表達量。

（2） Western blot檢測起搏相關蛋白：取左心室SAN區心肌組織，裂解以3000 r/min轉速離心10 min，取上清液，提取心肌組織蛋白，經BCA法檢測蛋白濃度;凝膠電泳后轉膜;5 %脫脂奶粉封閉孵育2 h，添加相應的一抗和二抗，選擇GAPDH作為內參，使用ECL法顯示蛋白。

1.4 統計學處理

應用 SPSS 22.0 軟件進行統計分析。所有實驗數據均符合正態分布，計量資料用（均數±標準差）表示，t檢驗;計數資料采用[n（%） ]表示，χ2檢驗。檢驗水準為α = 0.05，以雙側P < 0.05時，說明該數據具有顯著性統計學差異。

2 結果

2.1 SAN損傷模型兔SAN變化

與假手術組相比，甲醛濕敷組和甲醛滴注組可見SAN細胞出現明顯腫脹，部分粒細胞浸潤和膠原纖維組織增生。甲醛濕敷組和甲醛滴注組組織細胞形態學差異不明顯（P > 0.05） 。

2.2 不同損傷模型兔SAN功能比較

三組兔造模前SNRT、SNRTc和SACT比較無明顯差異。造模后，與假手術組相比，甲醛濕敷組和甲醛滴注組SNRT、SNRTc和SACT明顯上升（P < 0.05） ，且甲醛濕敷組SNRT、SNRTc和SACT明顯高于甲醛滴注組（P < 0.05） 。見表1。

2.3 不同損傷模型兔SAN區HCN1、HCN2、HCN3和HCN4mRNA表達

研究結果發現，甲醛濕敷組和甲醛滴注組主要以HCN4 mRNA表達為主，少量HCN1、HCN2表達，未檢出HCN3 mRNA 表達。甲醛濕敷組和甲醛滴注組HCN4 mRNA分別為（0.86±0.09） 、（0.63±0.07） 明顯低于假手術組HCN4 mRNA表達（1.02±0.01） ，且甲醛濕敷組HCN4 mRNA表達低于甲醛滴注組HCN4 mRNA表達（P < 0.05） 。

2.4 不同損傷模型兔SAN區HCN4蛋白表達

甲醛濕敷組和甲醛滴注組HCN4蛋白相對表達水平明顯低于假手術組，且甲醛濕敷組HCN4蛋白相對表達水平低于甲醛滴注組HCN4蛋白相對表達水平（P < 0.05） 。見圖1。

3 討論

SAN呈非特異性退行性纖維變性，是導致病態竇房結綜合征的重要因素[4]。在該病變過程中起搏細胞逐漸被纖維組取代，從而導致SAN起搏細胞的直接減少，其正常起搏功能逐漸減退[5]。這些起搏細胞擁有特殊的離子通道流的組合，當SAN受到損傷時，這些起搏細胞原有的功能會出現異常，導致嚴重的心動過緩、高度房室傳導阻滯等心律失常的發生。

本研究結果顯示，甲醛濕敷組和甲醛滴注組可見SAN細胞出現明顯腫脹，可見部分粒細胞浸潤和膠原纖維組織增生，但甲醛濕敷組和甲醛滴注組組織細胞形態學差異不明顯，說明甲醛濕敷和甲醛滴注均可對兔SAN區造成一定的損傷。本研究結果還發現，與假手術組相比，甲醛濕敷組和甲醛滴注組SNRT、SNRTc和SACT明顯上升，且甲醛濕敷組SNRT、SNRTc和SACT上升幅度明顯大于甲醛滴注組。甲醛滴注法利用SAN損傷電圖的特異性，角度新穎，同時對兔產生的創傷較小，但SAN電圖測量困難，容易受到自身或外界其他因素影響，使得造模損傷程度無法控制。甲醛濕敷法雖然對兔創傷大，但便于控制模型的損傷程度。本研究結果顯示，甲醛濕敷組SNRT、SNRTc和SACT下降幅度明顯大于甲醛滴注法，分析其原因可能是因為心臟表面光滑，不易于甲醛吸附在心臟表面，導致SAN損傷程度不足造成，其具體原因需進一步研究分析。本研究分析不同建模方式對起搏相關離子通道功能的影響發現，甲醛濕敷組和甲醛滴注組均以HCN4表達為主，少見HCN1、HCN2表達，且甲醛濕敷組HCN4 mRNA和蛋白表達水平明顯低于甲醛滴注組。HCN是一種環總超家族陽離子通道，主要存在于細胞膜上，其異常表達可能導致嚴重的SAN功能障礙[6]。既往研究顯示[7]，SAN免疫組化染色顯示HCN4表達位于結中央區，向周邊逐漸減少，甲醛加壓注射滲透法建立兔SAN組織損傷模型后，兔SAN組織HCN4蛋白表達有不同程度的下降。本研究結果說明，兩種SAN損傷建模方式對HCN4通道均有影響，但甲醛濕敷組影響較大，可能與其對SAN造成的損傷程度有關。

綜上所述，甲醛濕敷法建立兔SAN損傷模型優于甲醛滴注法。一個理想的制造病態竇房綜合征模型試劑，首先必須能對作用區域的心肌細胞造成一定程度的損傷。其次，其作用范圍及程度可控，不致使藥液作用范圍過大而損傷正常心肌組織。

參考文獻

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