傳統方法與分子生物檢測結核病的比較研究

王茂全

摘要：目的：比較傳統方法與分子生物檢測結核病的有效性。方法：選擇2016年～2017年在醫院就診的疑似結核患者90例。檢測方法采用分子生物檢測方法與傳統方法，比較兩種方法的有效性。結果：傳統方法檢出率為62.2%，生物檢測方法檢出率為82.2%。傳統方法檢出率低于分子生物檢測法檢出率（P < 0.05） ，差異具有統計學意義。兩方法檢測陽性符合率為75.6%。結論：在結核病檢測中，生物檢測方法比傳統方法有更多的優點，例如較為方便、速度快、出錯率低等，具有良好的診斷價值，適合臨床醫療在診療活動中使用。

關鍵詞：傳統方法;分子生物檢測方法;結核病;比較

結核病是由結核分枝桿菌所引起的一類傳染性疾病，是由單一病原體傳染而引發的死亡數最多的疾病[1～2]。在2010年，我國進行了一次結核病流行病學篩選，流調結果表明，我國每年有超過130萬的結核病病人，在全世界的結核病患者中，占比約13.2%，位居全球第二[3～4]。經過過去很長時間的努力，我國結核病的發病率在一定程度上得到了控制，結核病的發病情況趨于平穩。但最近這些年[5～6]，我國部分地區結核病再次增多，使得研究人員對此現象十分重視。結核病的初步預防很關鍵，重點依靠實驗室診斷、結核病的鑒定、診療的實施。當下結核病檢測方法需要的時間比較長，不符合臨床的實際需求，因此，必須研究一種新的方法[7]。文章選擇2016年～2017年來醫院就診的90例疑似患者，對傳統方法與分子生物檢測法進行對比，對所獲得的結果進行分析。現報道如下：

1 對象與方法

1.1 一般資料

本研究選擇2016年～2017年來醫院就診的90例疑似患者，其中男性占比5/9，女性占比4/9，所有患者的年齡30～73歲，年齡的均值與標準差分別是45.4歲、3.6歲，所有選定的患者都被告知本研究的科學目的，同時簽署了知情書。

1.2 方法

儀器：PCR儀器所采用的是宏石SLAN-96P。

標本采集液：在采集到的痰液標準樣板中加入4%NaOH飽和溶液，加至4倍痰液體積，混勻，室溫放置30 min使其液化，取1 mL置于離心管中。離心機12000 rpm，離心5min，除去上清，沉淀后加入1 mL無菌試驗生理鹽水，攪拌均勻，12000 rpm重復離心5 min，洗滌兩次[8～9]。沉淀后加入50 μDNA提取液，充分攪拌得到飽和溶液中的水不溶性成分，采集過程中應使用進樣器充分混合均勻平衡[10]。如果移液器吸頭太細而無法消化吸收或堵塞吸頭，使用未受污染的吸頭將其從移液器吸頭頂部取出并切成塊，然后置于金屬浴中10 min，離心5 min，12000 rpm。

檢驗方法：所有標本均通過提取病原載玻片、抗酸染色光學顯微鏡和熒光定量PCR檢查采集。取一個PCR反應管，插入已解析的質量保險單，8 000 rpm離心5秒，將反應管置于PCR檢測器中，增加至93℃預旋2 min，然后93℃45 s，55℃120 s，30個循環后，置于33℃條件下;PCR反應后檢測熒光，將PCR管充分冷藏至33℃，擴增后的反應管迅速放入熒光中，檢測儀讀取并記下數據，熒光激發波長487 mm，檢測波長525 mm。

1.3 統計學處理

統計分析軟件采用SPSS ，計量資料用均數、標準差表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料用百分比表示，兩兩比較采用χ2檢驗。P < 0.05，差異具有統計學意義。

2 結果

傳統方法檢測陽性56例，檢出率62.2%;分子生物檢測方法檢測陽性74例，檢出率82.2%。傳統方法陽性檢出率低于分子生物學檢測方法（P < 0.05） ，差異有統計學意義（χ2 = 8.792） 。兩方法檢測陽性符合率為75.6%（56/74） ，見表1

3 討論

結核病是由結核分枝桿菌所引起的，近年來流行率再次持續上升。結核病檢測是診斷結核病最特異的方法，痰涂片是肺結核患者診療、判斷、開具治療計劃、評估治療結果的常用方式或方法。涂片抗酸染色迅速方便，同時因為非典型分枝桿菌在中國基本上看不到，如果分枝桿菌出現陽性，那么大體上能夠判斷結核病。樣品在體外聚合，采用鏈式反應（PCR） 方法，擴增出結核桿菌中所含的DNA，并通過電泳進行檢測。該方法不用體外預培養，2d就可以獲得報告，節省時間并且很方便，可識別細菌種類，但不足之處是可能存在假陽性或假陰性的情況。 PCR技術的應用對于臨床療效評價、傳染病控制和發病機制調查具有重要意義。因為被結核桿菌所感染后并不會出現任何顯著的癥狀，只是PPD檢測結果是陽性，所以結核病的判斷是臨床科研以及結核病預防的關鍵。過去，肺結核的臨床判斷大多數是按照就診病人的臨床體征，再加上相應的檢測化驗數據，但由于很多的就診病人并未存在明顯的癥狀，所以臨床診斷困難。實驗室結核病的判斷大體上是以細菌涂片與痰培養為核心。痰涂片檢查法能夠判斷出結核病的傳染源，價格便宜，適合我國國情，然而檢測陽性率不高，進而使得對結核病的判斷不夠準確。然而在當下的結核病實驗室測試中，痰培養診斷還是金標準，尤其是針對藥敏檢測，在患者臨床用藥和耐藥性檢測等方面有著十分關鍵的價值，但檢測周期還是比較長，所以需要進行更新。

在治療結核病領域，生物技術逐漸獲得了廣泛的應用，其中便包括PCR熒光技術的廣泛應用 [11～15]。PCR技術采用結合分枝桿菌為非特異性引物、非特異性熒光探針、PCR反應液、高溫DNA聚合酶、單四多肽鏈等成分，在體外擴增的基礎上檢測結核分枝桿菌。

PCR技術在生物檢測法中的實施是在PCR反射中加入熒光功能基團，檢測熒光數據信號的積累，檢測PCR的全過程，并對樣品中DNA確定的過程。測試結果在1d內獲得[16～18]。PCR擴增在封閉狀態下進行，會降低環境的影響，減少陽性結果的出現，在檢測靈敏度上確定性很高[19]。

本研究獲取90份疑似患者痰標本，采用傳統方法、生物檢測法分別進行檢測，傳統方法痰涂片陽性率為62.2%，生物檢測方法陽性率為82.2%，兩種方法的差異具有統計學意義（P < 0.05）。

總而言之，在結核病的檢測過程中，生物檢測方法比傳統方法有更多的優點，例如較為方便、速度快、出錯率低等，具有良好的診斷價值，適用于臨床醫學用途。但是，隨著對結核分枝桿菌的科學研究不斷增多，許多新的檢測方法層出不窮，雖然每一種檢測方法都有其自身的優劣勢，而且部分新研究出來的檢測方法還未能在臨床上普及，甚至有一部分還在實驗室階段，但是相信隨著我國基礎醫學以及生物科技的不斷進步，研究探索從整體的角度進行，從細菌水平到分子水平，從傳統的實驗室方法到現代的實驗室方法，并且在各個層次和深度上不斷進化和完善，這樣就可以一個接一個地走進醫院，以理想化的方式成功完成結核病的檢測[20～22]。作為醫學檢驗技術人員，每個人都必須掌握新的專業知識和新技術應用，尋找一種高精度、非特異性、高靈敏度、簡便快捷的結核分枝桿菌檢測新方法。

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