CHOP/GADD153在胎兒生長受限患者胎盤組織中的表達及意義

林海英++++++張彥華++++++王開明++++++黃小紅

[摘要] 目的 探討內質網應激相關蛋白CHOP/GADD153在胎兒生長受限（FGR）患者胎盤組織中的表達及意義。 方法 選擇2012年7月～2013年5月深圳市寶安區婦幼保健院FGR孕婦46例為FGR組，另選擇孕齡正常孕婦34名為對照組。采用免疫組化法檢測CHOP/GADD153在各組胎盤組織中的表達，并采用Tunnel法檢測各組胎盤組織細胞凋亡率。 結果 FGR組胎盤組織CHOP/GADD153免疫組化陽性表達率67.8%，明顯高于對照組的14.7%，差異有高度統計學意義（χ2 = 7.57，P < 0.01）；FGR組胎盤組織細胞凋亡率為（37.6±5.3）%，明顯高于對照組的（12.3±1.5）%，差異有統計學意義（t = 2.342，P < 0.05）。 結論 內質網應激相關蛋白CHOP/GADD153介導的細胞凋亡與FGR的發生機制有關。

[關鍵詞] 胎兒生長受限；內質網應激；凋亡

[中圖分類號] R714.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）01（b）-0017-03

Expression and significance of CHOP/GADD153 in placenta of fetal growth restriction

LIN Haiying ZHANG Yanhua WANG Kaiming HUANG Xiaohong

Department of Obstetrics， Bao'an Maternal and Child Health Hospital in Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518100， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of endoplasmic reticulum stress homologous protein （CHOP/GADD153） in placenta of fetal growth restriction （FGR）. Methods 46 patients with FGR from July 2012 to May 2013 in Bao'an Maternal and Child Health Hospital in Shenzhen City were selected as FGR group， 34 normal pregnant women in the same term were selected as control group. Placental CHOP/GADD153 expression was evaluated by immunohistochemistry. Placental apoptosis was assessed by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling （Tunel） assay. Results The positive expression rate of CHOP/GADD153 in FGR group was 67.8%， which was higher than that in control group （14.7%）， the differences were statistically significant （χ2 = 7.57， P < 0.01）. The apoptotic ratio in FGR group was （37.6±5.3）%， which was higher than that in control group [（12.3±1.5）%]， the differences were statistically significant （t = 2.342， P < 0.05）. Conclusion Apoptosis mediated by endoplasmic reticulum stress homologous protein （CHOP/GADD153） is correlated with nosogenesis of FGR.

[Key words] Fetal growth restriction； Endoplasmic reticulum stress； Apoptosis

胎兒生長受限（fetal growth restriction，FGR）是妊娠期常見的并發癥之一，其發病率為3%～10%，我國發病率平均6.39%，其圍生兒病死率高，近期及遠期并發癥多，近期不僅影響胎兒的發育，遠期也影響兒童期及青春期的體能與智能發育，甚至與成年期一些疾病的發生也存在一定的相關性[1]。其發病機制不明，目前尚處于研究探索之中。本研究通過測定FGR患者胎盤組織中內質網應激相關蛋白CHOP/GADD153的表達及細胞凋亡，探討內質網應激介導的細胞凋亡與FGR發病的相關性，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年7月～2013年5月深圳市寶安區婦幼保健院FGR孕婦46例為FGR組，另選擇孕齡正常孕婦34例為對照組，均為單胎妊娠，已排除胎兒畸形及妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病等妊娠期并發癥及合并癥。FGR的診斷標準為足月胎兒出生體重<2500 g，或胎兒體重低于同孕齡平均體重的兩個標準差；或低于同孕齡正常體重第10百分位數[2]。FGR組年齡21～37歲，平均（31.4±4.1）歲；分娩孕齡34～39周，平均（36.9±2.6）周；胎次1～4次，平均（1.8±0.7）次。對照組年齡23～38歲，平均（29.4±3.6）歲；分娩孕齡34～40周，平均（37.5±2.9）周；胎次1～5次，平均（1.9±0.9）次。對照組與FGR組平均年齡、孕齡、胎次一般資料比較，差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。待胎盤娩出后，于母面近臍帶處，避開鈣化點迅速取胎盤組織約1 cm×1 cm×1 cm，置于10%中性福爾馬林液中固定，進一步檢測CHOP/GADD153的表達及細胞凋亡。本研究已經醫院倫理委員會通過，患者知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法檢測胎盤組織中CHOP/GADD153的表達 胎盤組織福爾馬林固定，石蠟包埋，制成切片。切片脫蠟、水化，采用胃蛋白酶進行抗原修復，滴加封閉液，37℃濕盒孵育30 min，滴加一抗（Cell Signaling公司，美國，鼠抗人，1∶100），37℃濕盒孵育2 h，TBS-T洗滌5 min×3次，滴加封閉液5 min×3次，滴加二抗（Cell Signaling公司，美國，羊抗鼠IgG，1∶200），37℃濕盒孵育30 min，TBS-T洗滌5 min×3次，滴加試劑Tween20，37℃濕盒孵育20 min；加HRP-SA，37℃濕盒孵育30 min，TBS-T洗滌5 min×3次，TBS洗滌5 min×2次，二氨基聯苯胺（DAB）顯色、復染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察成像。磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。每張切片隨機取5個非重疊400倍鏡視野，以鏡下細胞內出現棕黃色顆粒或團塊者為陽性細胞，陽性細胞占50%～100%為強陽性（+++），占25%～<50%為中度陽性（++），占5%～<25%為弱陽性（+），占0%～<5%為陰性（-）。觀察各組CHOP/GADD153表達及陽性細胞的分布情況。免疫組化表達總陽性率=（強陽性+中度陽性+弱陽性）細胞數/細胞總數×100%。

1.2.2 Tunnel法檢測胎盤組織細胞凋亡 所用試劑為細胞凋亡檢測試劑盒，購自武漢博士德生物技術有限公司。胎盤組織福爾馬林固定，石蠟包埋，制成切片。切片脫蠟入水。3% H2O2處理10 min，蒸餾水洗滌2 min×3次；proteinase K消化10～15 min，TBS洗2 min×3次；滴加標記緩沖液37℃標記2 h，TBS洗2 min×3次，加封閉液30 min，甩掉封閉液，加生物化抗地高辛抗體，37℃反應30 min，TBS洗2 min×3次；加SABC，37℃反應30 min，TBS洗5 min×4次；DAB顯色，蘇木精輕度復染。脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。未凋亡細胞的胞核染成藍色，凋亡細胞的細胞核呈棕黃色（Tunnel陽性）。隨機選取共5個非重疊400倍鏡視野，計數凋亡細胞數和總細胞數，細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗及秩和檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化法CHOP/GADD153在各組胎盤組織的表達

CHOP/GADD153主要表達于胎盤滋養細胞的細胞漿及細胞核中，呈棕黃色顆粒，見圖1、2，各組CHOP/GADD153表達強度變化見表1。FGR組胎盤組織CHOP/GADD153免疫組化陽性表達率和陽性級別明顯高于正常對照組，兩組比較差異有高度統計學意義（χ2 = 7.57，P < 0.01）。

圖1 對照組胎盤組織CHOP陰性表達（400×）

圖2 FGR組胎盤組織CHOP陽性表達（400×）

表1 兩組胎盤組織中CHOP/GADD153的表達情況（%）

注：與對照組比較，*P < 0.05；FGR：胎兒生長受限

2.2 各組胎盤組織細胞凋亡率

FGR組胎盤組織細胞凋亡率為（37.6±5.3）%，對照組胎盤組織細胞凋亡率為（12.3±1.5）%，FGR組明顯高于對照組，兩組比較差異有統計學意義（t = 2.342，P < 0.05）。見圖3、4及表2。

3 討論

FGR與多種妊娠期合并癥、并發癥及胎兒先天畸形等因素有關，但仍有約40%的FGR病因至今尚未明確，目前發病機制研究涉及瘦素、胰島素樣生長因子2I（IGF2I）、抗心磷脂抗體、血管內皮生長因子（VEGF）、胎盤生長因子（placenta growth factor，PLGF）等方面[3-6]。

近年來在FGR的發病機制研究中，有關胎盤細胞過度凋亡和凋亡與增殖之間的平衡紊亂日益受到學者的關注[7-9]。本研究發現，FGR胎盤組織細胞凋亡率明顯高于正常妊娠組，提示滋養細胞過度凋亡與FGR發病相關，與其他學者研究結論相同，但引起細胞凋亡的途徑值得進一步探討。

細胞凋亡除了死亡受體途徑、線粒體途徑外，目前較受關注的一種新的誘發凋亡途徑是內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑。內質網是真核細胞中重要的細胞器，是蛋白質翻譯、合成和細胞內鈣離子的儲存場所，其結構和功能的重要性決定了內質網對多種刺激非常敏感，如缺血、缺氧、饑餓、鈣離子平衡失調、自由基侵襲及藥物等都可以誘發ERS。ERS是應激時發生在細胞中的最初反應，是細胞本身的一種自我保護性機制。但是，反應過強或時間過長的ERS可以引起細胞功能失調，甚至細胞死亡[10-13]。CHOP/GADD153是轉錄因子家族C/EBP成員之一，在正常生理狀態下基本檢測不到，但在ERS時，被顯著誘導表達，參與調節細胞凋亡[14-15]。

本研究發現，FGR胎盤組織CHOP/GADD153表達明顯高于正常妊娠組，提示內質網應激途徑介導的細胞凋亡與FGR的發生機制有關。當機體遭遇不良刺激，誘發內質網應激，持久的應激引發細胞凋亡，影響母胎間營養交換，從而導致FGR。

目前FGR的治療尚無特別有效的方法，理論上營養治療有利于胎兒生長，但臨床通過靜脈營養治療，實際效果并不理想，可能與內質網應激介導的滋養細胞凋亡影響母胎營養交換有關，該研究發現可為FGR的治療提供新的靶點。

[參考文獻]

[1] Harding R，Cock ML，Louey S，et al. The compromised intrauterine enviroment：implications for lung health [J]. Clin Exp Pharma Physiol，2000，27（10）：965-967.

[2] 樂杰.婦產科學[M].7版，北京：人民衛生出版社，2008：130-132.

[3] 楊敬一，俞艇蔚.胰島素樣生長因子瘦素與胎兒生長受限的相關性研究[J].醫藥論壇雜志，2011，32（24）：6-7.

[4] 徐月芳，凌奕，林葉飛，等.胎兒生長受限患者sFlt-1、PLGF的表達及其意義[J].海南醫學院學報，2012，18（6）：838-839.

[5] 秦江霞，賈金平，岳玉煥.HIF-1α、VEGF 在胎兒生長受限患者胎盤組織中的表達及意義[J].中國優生與遺傳雜志，2012，20（12）：47-48，53.

[6] 葉艷貞，陳建宇，劉建玲，等.胎兒生長受限與抗心磷脂抗體的相關性[J].中國醫藥導報，2010，7（29）：36-37.

[7] Shen SF，Hua CH. Effect of L-arginine on the expression of Bcl-2 and Bax in the placenta of fetal growth restriction [J]. Matern Fetal Neonatal Med，2011，24（6）：822.

[8] 王鐵軍，屈新中.胎兒生長受限胎盤組織中細胞凋亡與增殖[J].中國婦幼保健，2010，25（33）：4873-4876.

[9] 崔世紅，張婷，管秀娟，等.特發性胎兒生長受限患者胎盤組織中XIAP 和Bax的意義[J].中國婦幼保健，2012， 27（13）：2030-2032.

[10] 江燕萍，孟錦繡，林燕燕.Apelin/APJ在胎兒生長受限胎盤組織中的表達及其臨床意義[J].現代醫院，2011， 11（9）：15-16.

[11] 黃鶯，孫海燕，李小英，等.胎膜早破孕婦血清白細胞介素-6、細胞黏附因子-1的表達及其臨床意義[J].中國醫藥導報，2013，10（4）：57-59.

[12] 顏耀華，李力，王云，等.胎盤生長因子于胎兒生長受限時在胎盤及蛻膜組織中的表達[J].第三軍醫大學學報，2007，29（3）：203-206.

[13] 王秀，茍文麗，朱廣俠.胎兒生長受限孕婦血清皮質醇濃度與胎盤組織IGF-1表達水平研究[J].實用婦產科雜志，2005，21（2）：87-90.

[14] 崔世紅，張婷，劉萍萍，等.激活素A、Bax和XIAP在特發性胎兒生長受限患者的表達及意義[J].實用婦產科雜志，2012，28（3）：211-214.

[15] Rasheva VI，Domingos PM. Cellular responses to endoplasmic reticulum stress and apoptosis [J]. Apoptosis，2009，14（8）：996-1007.

（收稿日期：2013-11-07 本文編輯：李繼翔）

[2] 樂杰.婦產科學[M].7版，北京：人民衛生出版社，2008：130-132.

[3] 楊敬一，俞艇蔚.胰島素樣生長因子瘦素與胎兒生長受限的相關性研究[J].醫藥論壇雜志，2011，32（24）：6-7.

[4] 徐月芳，凌奕，林葉飛，等.胎兒生長受限患者sFlt-1、PLGF的表達及其意義[J].海南醫學院學報，2012，18（6）：838-839.

[5] 秦江霞，賈金平，岳玉煥.HIF-1α、VEGF 在胎兒生長受限患者胎盤組織中的表達及意義[J].中國優生與遺傳雜志，2012，20（12）：47-48，53.

[6] 葉艷貞，陳建宇，劉建玲，等.胎兒生長受限與抗心磷脂抗體的相關性[J].中國醫藥導報，2010，7（29）：36-37.

[7] Shen SF，Hua CH. Effect of L-arginine on the expression of Bcl-2 and Bax in the placenta of fetal growth restriction [J]. Matern Fetal Neonatal Med，2011，24（6）：822.

[8] 王鐵軍，屈新中.胎兒生長受限胎盤組織中細胞凋亡與增殖[J].中國婦幼保健，2010，25（33）：4873-4876.

[9] 崔世紅，張婷，管秀娟，等.特發性胎兒生長受限患者胎盤組織中XIAP 和Bax的意義[J].中國婦幼保健，2012， 27（13）：2030-2032.

[10] 江燕萍，孟錦繡，林燕燕.Apelin/APJ在胎兒生長受限胎盤組織中的表達及其臨床意義[J].現代醫院，2011， 11（9）：15-16.

[11] 黃鶯，孫海燕，李小英，等.胎膜早破孕婦血清白細胞介素-6、細胞黏附因子-1的表達及其臨床意義[J].中國醫藥導報，2013，10（4）：57-59.

[12] 顏耀華，李力，王云，等.胎盤生長因子于胎兒生長受限時在胎盤及蛻膜組織中的表達[J].第三軍醫大學學報，2007，29（3）：203-206.

[13] 王秀，茍文麗，朱廣俠.胎兒生長受限孕婦血清皮質醇濃度與胎盤組織IGF-1表達水平研究[J].實用婦產科雜志，2005，21（2）：87-90.

[14] 崔世紅，張婷，劉萍萍，等.激活素A、Bax和XIAP在特發性胎兒生長受限患者的表達及意義[J].實用婦產科雜志，2012，28（3）：211-214.

[15] Rasheva VI，Domingos PM. Cellular responses to endoplasmic reticulum stress and apoptosis [J]. Apoptosis，2009，14（8）：996-1007.

（收稿日期：2013-11-07 本文編輯：李繼翔）

[2] 樂杰.婦產科學[M].7版，北京：人民衛生出版社，2008：130-132.

[3] 楊敬一，俞艇蔚.胰島素樣生長因子瘦素與胎兒生長受限的相關性研究[J].醫藥論壇雜志，2011，32（24）：6-7.

[4] 徐月芳，凌奕，林葉飛，等.胎兒生長受限患者sFlt-1、PLGF的表達及其意義[J].海南醫學院學報，2012，18（6）：838-839.

[5] 秦江霞，賈金平，岳玉煥.HIF-1α、VEGF 在胎兒生長受限患者胎盤組織中的表達及意義[J].中國優生與遺傳雜志，2012，20（12）：47-48，53.

[6] 葉艷貞，陳建宇，劉建玲，等.胎兒生長受限與抗心磷脂抗體的相關性[J].中國醫藥導報，2010，7（29）：36-37.

[7] Shen SF，Hua CH. Effect of L-arginine on the expression of Bcl-2 and Bax in the placenta of fetal growth restriction [J]. Matern Fetal Neonatal Med，2011，24（6）：822.

[8] 王鐵軍，屈新中.胎兒生長受限胎盤組織中細胞凋亡與增殖[J].中國婦幼保健，2010，25（33）：4873-4876.

[9] 崔世紅，張婷，管秀娟，等.特發性胎兒生長受限患者胎盤組織中XIAP 和Bax的意義[J].中國婦幼保健，2012， 27（13）：2030-2032.

[10] 江燕萍，孟錦繡，林燕燕.Apelin/APJ在胎兒生長受限胎盤組織中的表達及其臨床意義[J].現代醫院，2011， 11（9）：15-16.

[11] 黃鶯，孫海燕，李小英，等.胎膜早破孕婦血清白細胞介素-6、細胞黏附因子-1的表達及其臨床意義[J].中國醫藥導報，2013，10（4）：57-59.

[12] 顏耀華，李力，王云，等.胎盤生長因子于胎兒生長受限時在胎盤及蛻膜組織中的表達[J].第三軍醫大學學報，2007，29（3）：203-206.

[13] 王秀，茍文麗，朱廣俠.胎兒生長受限孕婦血清皮質醇濃度與胎盤組織IGF-1表達水平研究[J].實用婦產科雜志，2005，21（2）：87-90.

[14] 崔世紅，張婷，劉萍萍，等.激活素A、Bax和XIAP在特發性胎兒生長受限患者的表達及意義[J].實用婦產科雜志，2012，28（3）：211-214.

[15] Rasheva VI，Domingos PM. Cellular responses to endoplasmic reticulum stress and apoptosis [J]. Apoptosis，2009，14（8）：996-1007.

（收稿日期：2013-11-07 本文編輯：李繼翔）