C-Myc/Bcl-2蛋白雙表達(dá)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排的檢測及臨床意義

許 娟，楊文秀，馮江龍，濮珍紅，楊 光，沈丹丹

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是最常見的非霍奇金淋巴 瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL），其生物學(xué)行為和臨床過程都表現(xiàn)出很大的異質(zhì)性[1]。DLBCL的類型很多，最常見的是非特指的DLBCL。日常工作中最常用的Hans分型將DLBCL分為生發(fā)中心細(xì)胞型（germinal center B-cell like，GCB）和非生發(fā)中心細(xì)胞型（nongerminal center B-cell like，non-GCB）[2]，但 是這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能涵蓋大B細(xì)胞淋巴瘤的異質(zhì)性。雙表達(dá)淋巴瘤（double-expression lymphoma，DEL）是指同時具有C-Myc和Bcl-2蛋白高表達(dá)（C-Myc陽性表達(dá)細(xì)胞所占百分比≥40%和Bcl-2陽性表達(dá)細(xì)胞所占百分比≥70%）的DLBCL。在2016年更新的WHO造血和淋巴組織腫瘤分類（第4版）中提出的高級別B細(xì)胞淋巴瘤（high-grade B-cell lymphoma，HGBL）的診斷中，其中一類就是具有C-Myc、Bcl-2和（或）Bcl-6基因重排這一遺傳學(xué)改變的大B細(xì)胞淋巴瘤，即雙打擊（double-hit lymphoma，DHL）或三打擊淋巴瘤（triple-hit lymphoma，THL）[3]。DHL/THL發(fā)病率不高，但其C-Myc和Bcl-2蛋白陽性表達(dá)率高達(dá)80%～90%[4]，多數(shù)屬于DEL，有研究認(rèn)為，DHL和THL比DEL的臨床過程和預(yù)后更差。DEL對臨床上B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin’s lymphoma，B-NHL）常用的治療方案R-CHOP[利妥昔單抗（rituximab）＋環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide）＋多柔比星（adriamycin）＋長春新堿（oncovin）＋強(qiáng)的松（prednisone）]反應(yīng)較差，容易復(fù)發(fā)成為難治性B細(xì)胞淋巴瘤[5]。目前，對于這類淋巴瘤的有效治療方法一直在探索研究中[6]。淋巴瘤的免疫表型和遺傳學(xué)特征與臨床預(yù)后及其治療反應(yīng)密切相關(guān)[7]，故DEL遺傳學(xué)和免疫表型相關(guān)的研究是實(shí)施其個體化醫(yī)療的關(guān)鍵。不同的DEL病例C-Myc和Bcl-2雙表達(dá)的分子機(jī)制不盡相同，其生物學(xué)行為和遺傳學(xué)改變也有所差異，在DEL病例中探討C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因變化特點(diǎn)的研究尚鮮有報道。本研究擬通過免疫組織化學(xué)法檢測蛋白表達(dá)和熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）檢測基因斷裂情況，探討C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排在DEL中的發(fā)生及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例收集

收集2010年1月1日—2018年12月31日由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科確診的DLBCL病例資料，從中篩選出39例C-Myc和Bcl-2蛋白雙表達(dá)病例納入研究。

納入標(biāo)準(zhǔn)為：臨床病理資料完整，石蠟包埋腫瘤組織充足，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果提示C-Myc和Bcl-2均為高表達(dá)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理資料欠缺，石蠟包埋組織材料過少，并發(fā)其他惡性腫瘤，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果提示C-Myc和Bcl-2表達(dá)水平不滿足DEL診斷標(biāo)準(zhǔn)者。本研究內(nèi)容已獲得貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

抗C-Myc、Bcl-2、CD10、Bcl-6和多發(fā)性骨髓瘤癌基因1（multiple myeloma oncogene 1，MUM1）單克隆、羊抗小鼠和（或）兔IgG（二抗）[通用二步法試劑盒，小鼠和（或）兔增強(qiáng)聚合物法檢測系統(tǒng)]（PV-9001）、EDTA修復(fù)液、EB病毒編碼的小分子RNA（Epstein-Barr virus encode RNA，EBER）原位雜交檢測試劑盒及DAB染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，抗p65抗體單克隆購自美國Cell Signaling Technology公司；FISH探針[C-Myc（8q24）、Bcl-2（18q21）和Bcl-6（3q27）基 因雙色分離探針]及DAPI染色劑購自廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司。

光學(xué)顯微鏡DM6B和原位雜交儀（Thermobrite）均為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測C-Myc、Bcl-2和p65的表達(dá)情況

采用PV二步法，抗原修復(fù)采用高壓熱修復(fù)（C-Myc和Bcl-2使用EDTA修復(fù)液，p65、CD10、MUM1和Bcl-6使用檸檬酸鹽修復(fù)液），具體操作步驟按照PV-9001試劑盒操作說明進(jìn)行。一抗為抗C-Myc和Bcl-2單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶200）和抗p65單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶1 200）]。C-Myc、Bcl-2和p65檢測以本課題組既往檢測陽性病例檔案蠟塊作為陽性對照，用PBS代替一抗作為空白對照。

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果判定：以細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色信號為陽性。C-Myc陽性信號位于細(xì)胞核上，Bcl-2陽性信號位于細(xì)胞質(zhì)，p65陽性信號位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)（圖1）。隨機(jī)選擇10個不重復(fù)的視野（放大倍數(shù)為400倍），每個視野隨機(jī)計(jì)數(shù)400個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的比例，取10個視野的平均值作為該病例的表達(dá)率。參閱參考文獻(xiàn)[8]，C-Myc陽性細(xì)胞所占的比例≥40%為高表達(dá)，Bcl-2陽性細(xì)胞所占的比例≥70%為高表達(dá)，若C-Myc和Bcl-2均高表達(dá)則定義為C-Myc/Bcl-2雙表達(dá)的B細(xì)胞淋巴瘤；p65陽性細(xì)胞所占的比例≥20%為陽性表達(dá)[9]。

1.4 FISH檢測C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因的重排情況

Fig.1 The expressions of C-Myc,Bcl-2 and p65 proteins in diffuse large B cell lymphoma (DLBCL)patients with double expression of c-myc and Bcl-2 tissues were detected by immunohistochemistry (DAB staining,×400).圖1 免疫組織化學(xué)法檢測DEL組織中C-Myc、Bcl-2及p65蛋白的表達(dá)情況（DAB，×400）

根據(jù)HE染色切片觀察選擇典型病變區(qū)域作為雜交區(qū)域。檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行，簡述如下：切4 μm石蠟切片，65 ℃烘烤60 min，用二甲苯溶液脫蠟后，梯度乙醇溶液（100%→95%→85%→75%）復(fù)水；蒸餾水高壓噴氣后3 min，加入胃蛋白酶37 ℃消化25～40 min；用2×SSC溶液洗滌后，梯度乙醇溶液（75%→85%→95%→100%）脫水晾干，隨后避光加入6～10 μL探針[C-Myc（8q24）、Bcl-2（18q21）和Bcl-6（3q27）基因雙色分離探針]，85 ℃變性5 min，37 ℃雜交16～18 h；37 ℃條件下以2×SSC溶液、2×SSC/0.1% NP-40及75%乙醇溶液洗滌晾干后DAPI復(fù)染。圖像采集、分析和保存在FISH圖像分析軟件中完成。判讀標(biāo)準(zhǔn)：正常基因表現(xiàn)為2個紅色和綠色熒光融合的黃色信號；典型的基因斷裂信號類型是1個紅色、1個綠色和1個黃色信號。每個病例分析200個細(xì)胞，根據(jù)文獻(xiàn)出現(xiàn)1個紅色和1個綠色分離信號的腫瘤細(xì)胞＞10%確定為有重排[10]。

1.5 原位雜交法檢測EBER表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)步驟簡述如下：切石蠟切片（厚度為4 μm），65 ℃烘烤60 min，二甲苯溶液脫蠟，無水乙醇水化，室溫風(fēng)干，水浴箱37 ℃預(yù)熱濕盒加胃蛋白酶消化，去離子水洗后梯度乙醇溶液（75%→95%→100%）脫水，切片風(fēng)干后滴加地高辛標(biāo)記的EBER探針封閉過夜（37 ℃雜交儀中），滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體37 ℃孵育30 min，DAB顯色及蘇木精染色后鹽酸分化，梯度乙醇溶液（75%→95%→100%）上行脫水風(fēng)干加中性樹膠封片觀察結(jié)果。陽性判定：核表達(dá)陽性腫瘤細(xì)胞所占百分比≥10%認(rèn)為是EBER陽性。

1.6 隨訪

通過住院病歷資料收集患者臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，隨訪方式主要是電話咨詢，隨訪內(nèi)容包括患者首次確診后的治療方案、生存及復(fù)發(fā)情況。以首次確診時間為隨訪開始時間，患者死亡或失訪結(jié)束隨訪，存活患者隨訪截止日期為2020年3月1日。39例DEL病例中獲訪33例，失訪6例，獲訪率84.62%（33/39）；其中存活24例，死亡9例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS21.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher精確檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法繪制患者的總生存（overall survival，OS）時間曲線；生存曲線的比較采用對數(shù)秩檢驗(yàn)（log-rank），采用COX比例風(fēng)險回歸模型對預(yù)后進(jìn)行多因素統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床病理學(xué)特征

39例患者中男性20例，女性19例，男女比例為1.05∶1；中位年齡為64歲（范圍：28～79歲）；Hans分型：GCB型16例，non-GCB型23例；Ann Arbor分期：Ⅰ和Ⅱ期14例，Ⅲ和Ⅳ期25例；國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評 分：0～2分15例，3～5分24例；32例患者行乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測，＞245 U/L者17例，≤245 U/L者15例；原發(fā)部位：淋巴結(jié)內(nèi)15例，淋巴結(jié)外24例；Ki-67表達(dá)：腫瘤細(xì)胞≥80%者26例，＜80%者13例。p65蛋白表達(dá)陽性21例（non-GCB 16例，GCB 5例），陰性18例（non-GCB 7例，GCB 11例）；p65在non-GCB亞型中高表達(dá)（P＝0.025，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)）。

2.2 FISH檢測結(jié)果

FISH檢測結(jié)果（圖2）顯 示，C-Myc及Bcl-2基因單獨(dú)重排者均為9例（9/39，23.08%），Bcl-6基因單獨(dú)重排者12例（12/39，30.77%），DHL和THL者5例（2例為C-Myc和Bcl-2基因重排，1例為C-Myc和Bcl-6基因重排，2例為C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排），檢出率為5/39（12.82%）（DHL及THL臨床病理資料見表1），Bcl-2和Bcl-6基因同時發(fā)生重排者3例。

2.3 幾種基因重排與DEL臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

C-Myc、Bcl-2及Bcl-6基因重排與DEL臨床病理特征的關(guān)系見表2。C-Myc基因重排和HGBL與年齡有關(guān)，好發(fā)年齡＜60歲；Bcl-2和Bcl-6基因重排與免疫表型有關(guān)，好發(fā)于GCB型，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 生存分析結(jié)果

Fig.2 The C-Myc,Bcl-2 and Bcl-6 genes rearrangement in diffuse large B cell lymphoma (DLBCL)patients with double expression of C-Myc and Bcl-2 tissues were detected by fluorescence in situ hybridization (FISH) method (×1 000).圖2 FISH法檢測C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因的重排結(jié)果（×1 000）

表1 5例伴有C-Myc、Bcl-2和（或）Bcl-6基因重排DLBCL患者的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological characteristics of diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) with C-Myc、Bcl-2 and (or) Bcl-6 gene rearrangements

表2 4種基因重排對DEL臨床病理特征的影響Table 2 Effects of C-Myc,Bcl-2 and (or) Bcl-6 gene rearrangements on double-expression lymphoma(DEL) clinicopathological characteristics

39例DEL病例中獲訪33例，失訪6例，隨訪率為84.62%（33/39）；其中存活24例，死亡9例，中位存活時間為24.5個月。獲訪病例中診斷后接受R-CHOP方案治療者17例，RE-CHOP方案[R-CHOP＋依托泊苷（etoposide）]治療者5例，CHOP方案治療者4例，R-CHOP方案聯(lián)合自體干細(xì)胞移植者2例，CHOP方案聯(lián)合自體干細(xì)胞移植者1例，DAEPOCH方案[劑量調(diào)整（依托泊苷＋強(qiáng)的松＋長春新堿＋環(huán)磷酰胺＋多柔比星）]治療者1例，確診后未治療者4例，且經(jīng)治療后復(fù)發(fā)者6例，其余病例治療方案不詳。基因重排與DEL患者生存狀況的關(guān)系見圖3，其中Bcl-6基因重排陽性組OS期低于陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.037）。多因素COX回歸分析結(jié)果見表3。

Fig.3 Comparison of survival analysis between positive and negative double-expressing lymphoma gene rearrangement cases.A:C-Myc rearrangement positive vs negative cases (P=0.179);B:Bcl-2 rearrangement positive vs negative cases (P=0.087);C:Bcl-6 rearrangement positive vs negative cases (P=0.037);D:C-Myc,Bcl-2 and (or) Bcl-6 rearrangement positive vs negative cases (P=0.326).OS:Overall survival.圖3 Kaplan-Meier法分析C-Myc（A）、Bcl-2（B）和Bcl-6（C）基因重排以及HGBL（D）對DEL患者OS時間的影響

表3 DEL患者預(yù)后相關(guān)因素的多因素COX回歸分析Table 3 Multivariate COX regression analysis of prognostic factors related to diffuse large B cell lymphoma(DLBCL) patients with double expression of C-Myc and Bcl-2

3 討論

DLBCL的異質(zhì)性體現(xiàn)在病因、臨床過程、預(yù)后、細(xì)胞來源、遺傳學(xué)特點(diǎn)和免疫表型等多個方面。其中，腫瘤細(xì)胞的遺傳學(xué)特征和免疫表型對DLBCL的臨床預(yù)后有重要影響。位于染色體8q24上的C-Myc基因、18q21上的Bcl-2和3q27上的Bcl-6是重要的轉(zhuǎn)錄因子或凋亡相關(guān)蛋白編碼基因[9]，其表達(dá)的蛋白參與細(xì)胞的分化、生長、增殖以及凋亡等重要過程，對于HGBL的DHL和（或）THL中所出現(xiàn)的C-Myc、Bcl-2或Bcl-6基因的重排對其臨床過程和預(yù)后、治療效果都有明顯影響，使其容易發(fā)展成為復(fù)發(fā)/難治性的大B細(xì)胞淋巴瘤。然而，臨床中DEL遠(yuǎn)比DHL多見，雖然DEL的臨床過程和預(yù)后也較差。研究顯示，相當(dāng)一部分DEL中存在NFκB的異常表達(dá)，后者與DLBCL的不良預(yù)后有關(guān)。因此，DEL中C-Myc、Bcl-2或Bcl-6基因重排等遺傳學(xué)改變對其發(fā)生和發(fā)展以及免疫表型的影響值得進(jìn)一步予以探討。

本研究在對39例DEL的DLBCL患者的基因重排檢測中發(fā)現(xiàn)，C-Myc和Bcl-2基因重排檢出率均為23.08%（9/39），Bcl-6重排檢出率為30.77%（12/39）。與既往文獻(xiàn)報道相比[12-13]，本組DEL病例中C-Myc、Bcl-6和Bcl-2重排檢出率明顯高于其他非特指的DLBCL，尤其是DHL的檢出率（12.82%）明顯高于非特指的DLBCL。結(jié)果表明，C-Myc/Bcl-2雙表達(dá)對DHL和（或）THL的發(fā)現(xiàn)有初篩的意義，這與既往的報道一致。值得提出的是，本研究還發(fā)現(xiàn)在年齡＜60歲的DEL病例中，更容易發(fā)生C-Myc基因重排以及DHL和（或）THL；在本研究檢測出的5例DHL和（或）THL中，原發(fā)于扁桃和頭頸部者占大多數(shù)，并以GCB型DLBCL為主。這表明年齡＜60歲、原發(fā)扁桃和頸部的GCB型DEL對DHL和（或）THL診斷更有提示意義，對此類患者須進(jìn)行C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排的檢測。

既往文獻(xiàn)報道及本課題組前期研究[14-15]都發(fā)現(xiàn)，DLBCL中存在與NF-κB活化相關(guān)的多種基因異常，故轉(zhuǎn)錄因子NF-κB異常活化是DLBCL的重要特征，其異常活化在non-GCB型DLBCL中尤其明顯。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，39例DEL患者中p65（NF-κB最關(guān)鍵的組件之一）的陽性表達(dá)率為53.84%（21/39），21例陽性表達(dá)病例中non-GCB型16例，GCB型5例；在GCB和non-GCB型DEL病例中p65表達(dá)有明顯差異，p65在non-GCB亞型中顯示為高表達(dá)，這與本課題組在其他非特指DLBCL中的研究結(jié)果一致。p65表達(dá)在DHL和（或）THL病例中的陽性表達(dá)率為40%，低于其他的DEL病例（58.8%）；這一結(jié)果提示，在DHL和（或）THL病例中C-Myc和Bcl-2的表達(dá)與NF-κB活化可能無關(guān)，而是C-Myc和Bcl-2基因重排的結(jié)果，但2組間的p65表達(dá)水平未見差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究中DHL和（或）THL的研究病例數(shù)少有關(guān)。p65在DEL中陽性表達(dá)率在50%以上，這說明半數(shù)以上的DEL病例都存在NF-κB的異常活化。由于C-Myc和Bcl-2都是NF-κB通路的下游分子，本研究提示在上述基因重排陽性和陰性的病例中C-Myc和Bcl-2的表達(dá)都可能與p65表達(dá)有關(guān)。NF-κB異常活化是DLBCL的重要特征，故在基因重排陰性的DEL中，2種蛋白高表達(dá)是否與NF-κB活化有關(guān)或是其他的分子機(jī)制還需要擴(kuò)大研究范圍并采用多層次的研究方法進(jìn)行深入探討。

DEL和DHL都有較差的臨床過程、治療反應(yīng)和預(yù)后，這已經(jīng)被既往的研究所證實(shí)。LDH、IPI、臨床分期、發(fā)生部位和年齡都與DLBCL的臨床發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）與淋巴瘤發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性早有報道，其與免疫缺陷相關(guān)DLBCL的發(fā)生密切相關(guān)。本研究比較分析了39例DEL中不同基因重排情況，以及對患者部分臨床病理特征的影響，并分析了不同基因重排和一些臨床病理特征對患者生存狀況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，39例DEL病例中，Bcl-2與Bcl-6基因重排發(fā)生與DEL的Hans分型有關(guān)，這與既往報道一致；GCB型DEL病例中Bcl-2基因發(fā)生重排者明顯多于non-GCB型患者，但Bcl-6基因重排也在GCB型DEL中多見的結(jié)果，這與其他研究報道不同[16]。造成這一結(jié)果的原因是客觀的地區(qū)差異，還是本研究中病例的偏差還有待于擴(kuò)大研究樣本做進(jìn)一步的研究。本研究中發(fā)現(xiàn)，C-Myc基因重排與DHL和（或）THL發(fā)生與DEL患者年齡的關(guān)系也在本研究中被發(fā)現(xiàn)，在＜60歲的病例中發(fā)生率明顯高于≥60歲的病例。上述結(jié)果表明，C-Myc和Bcl-2基因重排可能是DEL，尤其是DHL和（或）THL中C-Myc和Bcl-2雙表達(dá)的又一個重要分子機(jī)制。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，有3例DEL為同時發(fā)生Bcl-2和Bcl-6基因重排，Hans分型是GCB-DEL，沒有發(fā)生骨髓浸潤，R-CHOP治療后都得到緩解。這說明DEL中不同的基因重排與其臨床過程和療效有關(guān)，Bcl-2和Bcl-6基因重排與DEL較好的臨床過程和療效可能有關(guān)，這有待進(jìn)一步擴(kuò)大研究和延長隨訪時間進(jìn)一步觀察。本研究還發(fā)現(xiàn)3種基因重排的發(fā)生與DEL患者的臨床分期、IPI、血清LDH水平及EB病毒感染無關(guān)。

眾所周知，瘤細(xì)胞分子遺傳學(xué)的改變對患者生存預(yù)后會產(chǎn)生明顯的影響。關(guān)于C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排以及DHL和（或）THL對患者預(yù)后及生存率的影響報道不一，既往研究認(rèn)為C-Myc重排陽性、Bcl-2重排陽性及DHL和（或）THL是較差的OS標(biāo)志[17]，而對于Bcl-6基因重排陽性對患者預(yù)后的影響目前尚未統(tǒng)一。本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-6基因重排陽性患者的生存狀況則較陰性患者差。而單一的C-Myc或Bcl-2基因重排、DHL陽性和陰性病例之間生存狀況沒有明顯差異，COX多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，3種基因重排及3種蛋白表達(dá)都不是C-Myc和Bcl-2雙表達(dá)DLBCL的預(yù)后相關(guān)因素。這一結(jié)果可能與本研究病例數(shù)少和回顧性研究的局限性相關(guān)，因此有關(guān)C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排對于DEL臨床過程和預(yù)后的研究，還需要進(jìn)一步開展更大樣本量、多中心和前瞻性隊(duì)列研究。

綜上所述，DEL病例中有較高的C-Myc、Bcl-2和Bcl-6基因重排發(fā)生率，而且與患者的年齡和Hans分型有關(guān)，不同的基因重排發(fā)生與DEL的臨床過程和預(yù)后有一定影響，應(yīng)該常規(guī)進(jìn)行這3種基因重排檢測為臨床治療方案的確定提供依據(jù)并發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良的相關(guān)因素。