miR-7-5p靶向KLF4基因調控食管癌細胞的增殖和遷移能力

彭 慧，陳 丹，李東林，魏蜀亮

食管癌是最常見的消化系統惡性腫瘤，具有高致死率。統計數據顯示，2018年全球食管癌約有57萬例新診斷病例和51萬例死亡病例，其中中國占新發病例的大部分，是全世界主要的公共衛生問題[1]。盡管食管癌的診斷技術和治療取得了進步，但食管癌患者的總體生存率仍然很差，因此食管癌新的治療方法對提高患者生存率具有重大意義[2]。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類高度保守的內源性表達的小型非編碼RNA，它們可以是腫瘤的啟動子或抑制因子[3]。miR-7-5p在非小細胞肺癌和肝細胞肝癌等多種惡性腫瘤中被報道為抑癌因子，與腫瘤惡性生物學行為密切相關[4-5]。目前，miR-7-5p在食管癌中的相關研究未見有報道。miRNA通過與相應靶信使RNA（mRNA）的3’-非翻譯區（3’-untranslated region，3’-UTR）直接相互作用并通過miRNA切割，在轉錄后基因表達中發揮主要作用[6]。在結直腸癌中Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）基因被證實是miR-7-5p的直接靶標[7]，KLF4屬于KLF家族成員，具有進化上高度保守的哺乳動物鋅指結構。KLF4在腫瘤的發生和發展中發揮重要作用，可以發揮癌基因的作用也可以發揮抑癌基因的作用[8-9]，其在食管癌中發揮的作用也不一致[10-11]。因此本文對miR-7-5p靶向KLF4在食管癌中發揮的作用進行了探究。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選擇2017年1月—2018年6月本院收治的40例食管癌患者的癌組織及其配對的癌旁組織（距離癌組織＞5 cm的非癌組織的標本）。所有患者手術前均未接受化療或放射治療，食管癌組織和癌旁組織均經病理學確診。標本收集獲得本院倫理委員會批準，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 細胞和試劑

食管癌TE1、Eca109和EC9706細胞以及人食管鱗狀上皮細胞Het-1購自美國模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。DMEM高糖培養液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國HyClone公司；TRIzol試劑、PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄和SYBR Premix EX TaqTMⅡqRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-7-5p、KLF4基因、內參照U6和GAPDH基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；miR-7-5p-模擬物（mimics）及陰性對照（negative control，NC）-mimics、攜帶有KLF4全基因的過表達KLF4質粒（重組載體pcDNA3.0-KLF4）（over-expression-KLF4，OEKLF4）及空載體pcDNA3.0、攜帶有KLF4全基因的重組質粒pGLO-KLF4-野生型（wild type，WT）（KLF4-WT）和重組質粒pGLO-KLF4-突變型（mutant type，MUT）（KLF4-MUT）購自上海吉凱基因科技有限公司；雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑有限公司；MTS增殖檢測試劑盒購自中國北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室購自美國Coring公司；RIPA和BCA檢測試劑盒購自北京索萊寶試劑有限公司；兔抗人Wnt3a、β-連環蛋白（β-catenin）和內參照GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的羊抗兔IgG購自英國Abcam公司。

1.3 實時熒光定量PCR檢測組織中miR-7-5p及KLF4 mRNA的表達水平

手術切除的新鮮組織即刻放入液氮中凍存。取部分組織，經研缽研磨為組織粉末后加入TRIzol試劑，提取組織中的RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Premix EX TaqTMⅡqRT-PCR試劑盒進行PCR擴增；條件為95 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s、70 ℃30 s，共40個循環。用2－ΔΔCt值表示目的基因的相對表達量，以U6為內參照計算miR-7-5p的相對表達量，以GAPDH基因為內參照計算KLF4 mRNA相對表達量。miR-7-5p上游引物序列 為5’-AAAACTGCTGCCAAAACCAC-3’，下游引物序列為5’-GCTGCATTTTACAGCGACCAA-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物序列為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’；KLF4基因上游引物序列為5’-CCCACATGAAGCGACTTCCC-3’，下 游引物序列為5’-CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA-3’；GAPDH基因上游引物序列為5’-GTGAACCATGAGAAGTATG-3’，下游引物序列為5’-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3’。

1.4 細胞培養和轉染

食管癌細胞TE1、Eca109、EC9706和人食管鱗狀上皮細胞Het-1復蘇后重懸至含有10%胎牛血清的培養液中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%、全濕度培養箱中進行培養。細胞融合度約為95%時，按照1∶3的比例進行傳代。待細胞長滿時，采用胰蛋白酶消化后收集細胞，PBS洗3次，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-7-5p和KLF4 mRNA的表達水平，實驗流程同1.3節。

將miR-7-5p表達水平最低的食管癌細胞常規培養后，以1×105個的密度接種于6孔板中，分 為NC-mimics組、miR-7-5p-mimics組和miR-7-5p-mimics＋OE-KLF4組。細胞接種12 h后采用LipofectAMINE 2000進行質粒轉染，miR-7-5p-mimics轉入TE1細胞為miR-7-5p-mimics組，miR-7-5p-mimics和攜帶有KLF4全基因的重組載體[過表達KLF4（OE-KLF4）]共轉入TE1細胞為miR-7-5p-mimics＋OEKLF4組，以轉入無相關性的NC-mimics作為對照組。轉染后置于培養箱中培養，12 h后更換為新鮮培養葉繼續培養。

1.5 miR-7-5p靶向調控KLF4基因的驗證

TargetScan 7.1軟 件（http://www.targetscan.org/）預測miR-7-5p可能的靶基因。將KLF4的野生型3’-UTR和突變型3’-UTR分別被插入到基于pGL3的熒光素酶報道質粒中，構成KLF4-WT和KLF4-MUT重組質粒。

將miR-7-5p表達最低的食管癌細胞常規培養后，以3 000個/孔的密度接種到96孔板中，分為KLF4-WT＋NC-mimics組，KLF4-WT＋miR-7-5p-mimics組；KLF4-MUT＋NCmimics組和KLF4-MUT＋miR-7-5p-mimics組。收集轉染48 h后的各組細胞，采用雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.6 MTS實驗

選擇miR-7-5p表達最低的食管癌TE1細胞，以1 500個細胞/孔的密度接種到96孔板中，分為NC-mimics組、miR-7-5p-mimics組 和miR-7-5p-mimics＋OE-KLF4組，細胞轉染的實驗流程同1.4節，分別在細胞轉染的0、24、48和72 h時，加入30 μL MTS試劑，置于37 ℃、CO2體積分數為5%、全濕度培養箱中孵育2 h。采用酶標儀檢測細胞在490 nm處的D值。

1.7 Transwell小室法檢測TE1細胞的遷移能力

收集轉染48 h的各組細胞，用PBS洗滌3次后，以5×104個細胞重懸于100 μL無血清DMEM培養液中，加至Transwell小室上室的微孔膜上；將Transwell小室放入含有500 μL完全培養液的24孔板中，使微孔膜與24孔板中的培養液接觸。置于37 ℃、CO2體積分數為5%、全濕度培養箱中培養12 h后終止培養；用PBS將微孔膜上室面細胞的洗去后，用無水甲醇溶液固定細胞、結晶紫染色后，觀察細胞形態，隨機選擇5個視野計數穿過小室膜的細胞數。

1.8 蛋白質印跡法檢測Wnt3a蛋白的表達水平

收集轉染48 h的各組細胞，PBS洗滌3次后，加入RIPA試劑重懸細胞，超聲裂解30 min后低溫離心，收集上清液移，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取適量蛋白加入上樣緩沖液，煮沸進行蛋白變性，上樣行10%的SDS-PAGE分離蛋白，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，用含8%脫脂牛奶的封閉液封閉非特異性蛋白；加入一抗[兔抗人Wnt3a、β-catenin和GAPDH多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）]4 ℃孵育過夜，隨后加入二抗[HRP標記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶8 000）]，室溫孵育1 h，電化學發光法顯影。

1.9 統計學方法

用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。數據均以表示，獨立樣本t檢驗分析2組間的統計學差異，單因素方差比較3組及3組以上的統計差異。P＜0.05為差異有統計學意義。相關性分析采用的Pearson相關性統計。所有的實驗獨立重復3次或以上。

2 結果

2.1 食管癌組織中miR-7-5p和KLF4的表達水平

實時熒光定量 PCR檢測miR-7-5p和KLF4分別在食管癌和癌旁組織中的表達水平。結果（圖1A）顯示，miR-7-5p在食管癌組織中的表達量為0.78±0.46，在癌旁組織中的表達量為1.00±0.50，與癌旁組織相比，食管癌組織中miR-7-5p的表達水平下降（t＝2.06，P＝0.043）。KLF4 mRNA在食管癌組織中的表達為1.83±0.75，在癌旁組織中的表達為1.00±0.55，與癌旁組織相比，食管癌組織中KLF4 mRNA的表達水平增加（t＝5.71，P＝0.000）（圖1B）。

2.2 miR-7-5p和KLF4 mRNA在食管癌組織中的表達相關性

Pearson分析結果（圖2）顯示，miR-7-5p和KLF4 mRNA在食管癌組織中的表達呈負相關性（r＝－0.601，P＜0.05）。

2.3 食管癌細胞系中miR-7-5p和KLF4 mRNA的表達水平

實時熒光定量PCR檢測miR-7-5p和KLF4 mRMA在食管癌細胞中的表達水平。結果（圖3A）發現，miR-7-5p在食管癌TE1、Eca109和EC9706細胞中的相對表達量分別為0.19±0.03、0.65±0.06和0.50±0.02，在人食管鱗狀上皮細胞Het-1中的相對表達量為1.00±0.00；與Het-1細胞相比，miR-7-5p在食管癌細胞中的表達水平均明顯下調（P值均＜0.001），以在TE1細胞中表達量最低。

實時熒光定量PCR法檢測結果（圖3B）顯示，KLF4 mRMA在TE1、Eca109和EC9706細 胞中的表達量分別為6.79±0.69、5.83±0.52和4.09±0.12，在Het-1細胞中的表達量為1.00±0.00；與Het-1細胞相比，KLF4 mRMA在食管癌細胞中的表達水平均明顯上調（P值均＜0.001）。

2.4 miR-7-5p對KLF4的靶向調控作用

TargetScan 7.1軟件在線預測結果（圖4A）顯示，KLF4基因啟動子區與miR-7-5p具有結合位點。

雙熒光素酶報道基因系統檢測結果（圖4B）顯示，KLF4-WT＋NC-mimics共轉染組的熒光素酶活性為1.00±0.02，KLF4-WT＋miR-7-5p-mimics共轉染組的熒光素酶活性為0.33±0.05，較KLF4-WT＋NC-mimics共轉染組明顯降低（t＝4.01，P＝0.006）；而KLF4-MUT＋NC-mimics共轉染組的熒光素酶活性為1.00±0.05、KLF4-MUT＋miR-7-5pmimics共轉染組的熒光素酶活性為0.90±0.12，二者間差異無統計學意義（t＝1.25，P＝0.069）。上述結果提示，miR-7-5p靶向負調控KLF4基因。

2.5 miR-7-5p-mimics轉染效果及對KLF4 mRNA表達水平的影響

選擇miR-7-5p表達最低的食管癌細胞TE1，轉入miR-7-5p-mimics。實時熒光定量PCR法檢測結果（圖5）顯示，miR-7-5p在NC-mimics組中的相對表達量為1.00±0.00，在miR-7-5pmimics組中的相對表達量為8.35±0.97；與NCmimics組相比，miR-7-5p-mimics組中miR-7-5p的表達水平明顯上調（t＝3.47，P＝0.018）。KLF4 mRNA在NC-mimics組中的相對表達量為1.00±0.00，在miR-7-5p-mimics組中的相對表達量為為0.46±0.15，與NC-mimics組相比，miR-7-5p-mimics組中KLF4 mRNA的表達水平明顯下調（t＝2.99，P＝0.021）。

2.6 miR-7-5p調控KLF4對TE1細胞增殖能力的影響

MTS實驗檢測結果（圖6）顯示，與NCmimics組相比，miR-7-5p-mimics組和miR-7-5p mimics＋OE-KLF4組TE1細胞的增殖能力均明顯降低（P值均＜0.05）；而與miR-7-5p-mimics組相比，miR-7-5p-mimics＋OE-KLF4組TE1細胞的增殖能力增加（P＜0.05）。這一結果提示，KLF4基因表達水平的上調能抑制miR-7-5p對TE1細胞增殖的促進作用。

Fig.1 Real-timefluorescentquantitativePCRwas usedtodetectthe expressionlevelsofmiR-7-5p(A)andKrüppellikefactor 4 (KLF4)mRNA(B)in40 casesof esophageal cancerandadjacent non-cancerous tissues.*P＜0.05.圖1 實時熒光定量PCR檢測miR-7-5p（A）和KLF4 mRNA（B）在40例在食管癌和癌旁組織中的表達水平

Fig.2 Correlation between miR-7-5p and Krüppel-like factor 4 (KLF4) mRNA expression in esophageal cancer tissues.圖2 miR-7-5p和KLF4 mRNA在食管癌組織中表達的相關性

Fig.3 The expression level of miR-7-5p (A) and Krüppel-like factor 4 (KLF4) mRNA (B) in esophageal cancer TE1,Eca109 and EC9706 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.***P＜0.05,vs human esophageal squamous epithelial Het-1 cells (n=3).圖3 實時熒光定量PCR檢測miR-7-5p（A）和KLF4 mRMA（B）在食管癌TE1、Eca109和EC9706細胞中的表達水平

Fig.4 The targeted regulation of miR-7-5p on Krüppel-like factor 4 (KLF4).A:The binding site between the promoter region of KLF4 gene and miR-7-5p was predicted using TargetScan 7.1;B:The regulation of miR-7-5p on KLF4 was detected by double luciferase reporter assay.*P＜0.05 (n=3).圖4 采用TargetScan 7.1在線預測miR-7-5p與KLF4基因的相關性（A），并用雙熒光素酶報道基因系統予以驗證（B）

Fig.5 Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression levels of miR-7-5p (A) and Krüppel-like factor 4 (KLF4) mRNA (B) in TE1 cells transfected with negative control (NC)-mimics or miR-7-5pmimics.*P＜0.05,vs NC-mimics group (n=3).圖5 實時熒光定量PCR檢測轉入miR-7-5p-mimics對TE1細胞中miR-7-5p和KLF4 mRNA表達水平的影響

Fig.6 The effect of miR-7-5p on the proliferation of TE1 cells through regulating Krüppel-like factor 4(KLF4).*P＜0.05,vs NC-mimics group;△P＜0.05,vs miR-7-5p-mimics group (n=3).圖6 MST法檢測miR-7-5p調控KLF4對TE1細胞增殖能力的影響

2.7 miR-7-5p調控KLF4對TE1細胞遷移能力的影響

Transwell實驗檢測結果（圖7）顯示，NCmimics組穿過小室膜的細胞數為（79.33±6.5）個，miR-7-5p-mimics組穿過小室膜的細胞數為（19.67±1.42）個，miR-7-5p-mimics＋OEKLF4組穿過小室膜的細胞數為（40.67±3.98）個；與NC-mimics組 相比，miR-7-5p-mimics組 和miR-7-5p-mimics＋OEKLF4組細胞遷移能力降低（P＜0.05）；而與miR-7-5p-mimics組相比，miR-7-5p mimics＋OE-KLF4組細胞遷移能力增加（P＜0.05）。這一結果提示，上調KLF4基因表達能減弱miR-7-5p對TE1細胞遷移能力的抑制作用。

2.8 miR-7-5p調控KLF4對Wnt/β-catenin信號通路的影響

蛋白質印跡法檢測結果（圖8）顯示，與NC-mimics組相比，miR-7-5p-mimics組和miR-7-5p mimics＋OE-KLF4組細胞中Wnt3a和β-catenin蛋白的表達水平降低。而與miR-7-5pmimics組相比，miR-7-5p-mimics＋OE-KLF4組細胞中Wnt3a和β-catenin蛋白表達增加，KLF4減弱miR-7-5p 對Wnt3a和β-catenin的抑制作用。

Fig.7 The effect of miR-7-5p on the migration ability of TE1 cells regulating Krüppel-like factor 4 (KLF4)(crystal violet staining,×200).*P＜0.05,vs NC-mimics group;△P＜0.05,vs miR-7-5p-mimics group (n=3).圖7 miR-7-5p調控KLF4對TE1細胞遷移能力的影響

Fig.8 miR-7-5p attenuates the influence of Krüppel-like factor 4 (KLF4) on Wnt/β-catenin pathway.*P＜0.05,vs NC-mimics group;△P＜0.05,vs miR-7-5p-mimics group (n=3).圖8 miR-7-5p負靶向調控KLF4對Wnt/β-catenin的影響

3 討論

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，是與腫瘤相關死亡的第6大主要原因，也是全球第7大最普遍的腫瘤[1]。食管癌包括食管鱗狀細胞癌和食管腺癌2種組織類型，食管腺癌在發達國家常見，而食管鱗狀細胞癌在亞洲和其他發展中國家更常見，占中國食管癌病例的90%以上[12]。食管鱗狀細胞癌具有直接侵襲和早期轉移的能力，同時早期癥狀具有隱匿性，因此食管癌患者在初診時通常已伴有晚期轉移癥狀。早期食管癌患者的治療仍然是手術切除為主，輔以放化療，而晚期患者的治療主要采取放化療，由于腫瘤具有相當大的異質性，對放化療的反應差異很大，放化療抵抗性限制了食管癌患者治療效果，導致其預后較差，5年生存率＜5%[2]。目前，食管癌的發病機制尚未明確，因此研究與食管癌惡性進展密切相關的分子是探索食管癌新型藥物的重要策略。

miRNA是一類短鏈非編碼RNA，長度為20～24個核苷酸，目前在人類基因組中注釋了3 000多個miRNA；miRNA的失調在許多人類疾病中，尤其在惡性腫瘤中被發現，因此可作為腫瘤患者早期診斷的標志物或作為患者生存和預后的預測因素。多項研究表明，miRNA可以作為腫瘤治療的靶點進行抗腫瘤治療[3]。miR-7是從miR-7-1、miR-7-2和miR-7-3轉錄而成的，它們都具有相同的成熟miRNA序列。miR-7-5p是該家族中研究最多的miRNA序列[13]。研究報道，miR-7-5p在非小細胞肺癌組織和細胞系中表達下調，其在體外和體內均抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質轉化[4]；miR-7-5p可抑制肝細胞肝癌細胞在小鼠體內的人成瘤作用，腫瘤體積和質量的增長[5]；上述研究提示，miR-7-5p在非小細胞肺癌和肝細胞肝癌中發揮抑癌作用[4-5]，但是其在食管癌中的作用仍未知。因此，本研究中首先檢測了miR-7-5p在食管癌組織中的表達水平，實時熒光定量PCR結果顯示，與配對的食管癌癌旁組織相比，食管癌組織中miR-7-5p的表達水平下調，表明miR-7-5p在食管癌中可能也發揮抑癌作用。miR-7-5p在結直腸癌組織中的低表達能夠預測患者5年總體生存率低，其過表達抑制結直腸癌細胞增殖和遷移能力[7]。本研究未對患者的預后進行隨訪，因此在后續實驗中需擴大組織樣本進行進一步驗證。本研究在細胞水平探討了miR-7-5p在食管癌中發揮的具體作用，實時熒光定量PCR檢測結果顯示miR-7-5p在3株食管癌細胞中的表達均低于其在食管鱗狀上皮細胞中的表達水平，與在組織中的表達水平一致。選擇miR-7-5p表達最低的食管癌細胞進行miR-7-5p-mimics的轉染，功能實驗顯示過表達miR-7-5p后，食管癌細胞的增殖和遷移能力均降低，表明miR-7-5p可抑制食管癌細胞的惡性進展。

一個miRNA可以調節數百或數千種不同的mRNA，調控靶mRNA是miRNA發揮作用的分子機制[6]。miR-7-5p已經明確的靶基因包括神經腫瘤腹側抗原2（neuro-oncological ventral antigen 2，NOVA2）和p21激活的激酶2（P21-activated kinase 2，PAK2）等基因[4,13]。DONG等[7]報道，miR-7-5p在結直腸癌中通過靶向KLF4基因抑制腫瘤的進展，本文采用TargetScan 7.1軟件預測miR-7-5p與KLF4的結合位點，并在食管癌細胞中利用雙熒光素酶報告基因證實KLF4是miR-7-5p的靶基因，表明miR-7-5p可能通過KLF4抑制食管癌的增殖和遷移能力。KLF4是腫瘤相關轉錄因子，研究報道顯示其在不同的腫瘤中可能發揮相反的作用，如KLF4通過轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）信 號通路維持結直腸癌細胞的干性和間質特性[8]，而非小細胞肺癌中過表達KLF4，細胞的遷移和侵襲能力降低[9]。然而，KLF4在食管癌中的作用報道也不一致，SHAVERDASHVILI等[10]報道提示，KLF4通過激活核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號轉導通路促進食管癌細胞的發生；CHEN等[11]報道提示，KLF4通過凋亡誘導和細胞周期阻滯增強順鉑對食管癌細胞的敏感性。本研究中采用實時熒光定量PCR檢測發現，KLF4 mRNA在食管癌組織和細胞系中的表達水平均明顯升高，并且相關性分析結果顯示食管癌組織中KLF4與miR-7-5p的表達呈負相關性。進一步研究發現，miR-7-5p-mimics組中KLF4 mRNA的表達水平明顯降低，表明miR-7-5p負調控KLF4的表達；同時通過過表達KLF4，在功能研究中發現KLF4可以回復miR-7-5p對食管癌細胞增殖和遷移的抑制作用，表明miR-7-5p可能是通過負調控KLF4參與食管癌的進展。Wnt3a和β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的重要基因，Wnt/β-catenin是與腫瘤增殖和遷移密切相關的信號通路[14]，Wnt3a和β-catenin在食管癌中均高表達[15]，促進食管癌的惡性生物學行為，而本研究發現miR-7-5p抑制Wnt3a和β-catenin的表達，而KLF4可以回調這種抑制作用，表明miR-7-5p靶向KLF4調控Wnt/β-catenin抑制食管癌增殖和遷移能力。

綜上所述，miR-7-5p在食管癌組織和細胞系中低表達，KLF4在食管癌組織和細胞系中高表達，miR-7-5p靶向KLF4抑制食管癌細胞增殖和遷移能力，可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發生的。本研究結果提示，miR-7-5p可能是治療食管癌的一個新的分子靶點。