能譜CT成像評價兔VX2肺移植瘤乏氧程度的實驗研究

林了一 余 燁 程杰軍 張 鳳 傅奕鋮 吳華偉

肺癌是世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)死亡的首要原因之一［1］，腫瘤中乏氧細胞產(chǎn)生是晚期非小細胞肺癌放療抵抗的重要原因。腫瘤乏氧微環(huán)境能夠維持低氧狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤組織血供異常，并產(chǎn)生乏氧細胞，從而引起相關(guān)腫瘤生物學(xué)特性的改變，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。能譜CT 成像是一種以瞬時雙能切換為核心的雙能量CT 成像技術(shù)，能夠獲取病灶的單能量CT 值、碘濃度以及能譜曲線斜率等多項定量參數(shù)，在客觀評估病變的組織特性及功能狀態(tài)方面具有較大的應(yīng)用潛力［3-4］。本研究擬建立兔VX2 肺移植瘤模型并進行能譜CT 成像，探討肺癌乏氧區(qū)域的能譜CT 成像特點，分析能譜CT定量參數(shù)在腫瘤不同乏氧情況下的差異。

方 法

1. 動物模型建立

實驗動物為清潔級新西蘭大白兔，雌雄不限，體重2～3 kg。在CT 掃描定位下行肺穿刺種植VX2 腫瘤，并在種植腫瘤2 周后進行常規(guī)CT 掃描檢查，觀察腫瘤生長情況。取種植成功、腫瘤生長合適的實驗兔進行能譜CT成像。

2. 能譜CT檢查

采用寶石能譜CT 儀（Discovery CT 750 HD，GE Healthcare，Milwaukee，USA）對實驗兔進行CT掃描，先平掃確定腫瘤部位和范圍，再對腫瘤行能譜CT 增強掃描。主要掃描參數(shù)：管電壓為80 keV 和140 keV（0.5 ms 瞬時切換），管電流為260 mA，層厚和間隔均為5 mm。對比劑應(yīng)用碘帕醇（含碘量370 mg／ml），采用高壓注射器行兔耳緣靜脈注射，流速1 ml／s，總量5 ml，隨后注射2 ml 生理鹽水，流速1 ml/s。動脈期掃描應(yīng)用CT 監(jiān)測主動脈，主動脈CT值達到100 HU時自動觸發(fā)掃描，靜脈期掃描設(shè)置為動脈期掃描開始后延遲20 s自動采集。

3. 能譜CT參數(shù)測量

由2 位從事肺部影像診斷多年的醫(yī)師共同閱片后獲得一致意見，測量能譜CT 參數(shù)。選擇腫瘤的最大橫截面及上下2 個層面，感興趣區(qū)（region of interest，ROI）面積接近腫瘤面積的2/3，最后取平均值。選擇70 keV 是由于單能量70 keV 與傳統(tǒng)120 kV 峰值掃描圖像能量相近；其次，能譜CT 雙能量瞬時切換產(chǎn)生單能量圖像，相對傳統(tǒng)CT 模式不會產(chǎn)生混合能量CT 圖像，模擬120 kV 峰值的同時能夠提供更準確的單能量CT 值［5］。測量能譜CT 定量參數(shù)70 keV CT 值、 標準 化 碘 濃 度（normalized iodine concentrations，NIC），通過40 keV 及100 keV 單能量CT值計算能譜曲線斜率λHU。

4. 腫瘤組織免疫組織化學(xué)檢測

能譜CT成像檢查結(jié)束后，處死動物前2 h將乏氧探針哌莫硝唑（60 mg／kg）通過耳緣靜脈注射入實驗兔體內(nèi)，處死動物后取出其肺腫瘤組織，采用免疫組織化學(xué)二步染色法進行腫瘤乏氧探針染色，低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α）染色，以及微血管密度（microvessel density，MVD）測量的CD31染色。乏氧探針染色及HIF-1α染色陽性率判讀，以陽性著色強度和陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比乘積進行半定量處理［6］。依據(jù)乏氧評分對腫瘤的乏氧程度進行分組，染色結(jié)果≤3 分為弱乏氧組，染色程度＞3 分為強乏氧組。MVD 計數(shù)：利用CD31 單克隆抗體標記腫瘤微血管，呈棕褐色或棕黃色，按照Weldner等［7］的評估標準進行計數(shù)。

5. 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用專業(yè)統(tǒng)計軟件SPSS 24.0 以及MedCalc 12.0進行，連續(xù)變量用平均值±標準差表示。采用獨立樣本t 檢驗、非參數(shù)檢驗比較連續(xù)變量的差異。 采用受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析比較能譜CT 定量參數(shù)對VX2 腫瘤組織內(nèi)乏氧程度的預(yù)測準確性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

用30只新西蘭大白兔建立VX2肺移植瘤模型，2周后行腫瘤CT 平掃檢查發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)出現(xiàn)結(jié)節(jié)病灶為有效模型，最后納入22 只成功種植的實驗兔（腫瘤25個），所有標本在實驗中均經(jīng)病理證實為腫瘤組織，腫瘤平均長徑為（12.69±5.94）mm。依據(jù)乏氧探針染色結(jié)果分組：強乏氧組有實驗兔11只，腫瘤14個；弱乏氧組有實驗兔11只，腫瘤11個。

能譜CT 定量參數(shù)（圖1）靜脈期NIC、靜脈期λHU在不同乏氧程度的兔VX2 肺移植瘤之間存在顯著差異。強乏氧組的靜脈期NIC高于弱乏氧組的靜脈期NIC，強乏氧組的靜脈期λHU同樣高于弱乏氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而動靜脈期40 keV 及100 keV CT 值、動脈期70 keV CT 值、動脈期NIC、動脈期λHU和靜脈期70 keV CT 值在強乏氧組和弱乏氧組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。此外，腫瘤長徑在不同乏氧程度分組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)VX2 肺移植瘤內(nèi)MVD 和HIF-1α 水平在不同乏氧程度的兔之間均存在顯著差異：強乏氧組的MVD 計數(shù)顯著高于弱乏氧組（27.56±6.48 vs 20.35±4.68，P=0.012），強乏氧組的HIF-1α 表達顯著高于弱乏氧組（4.13±1.50 vs 2.44±1.02，P=0.008）。

ROC 曲線分析顯示，靜脈期NIC 及靜脈期λHU對預(yù)測兔VX2 肺移植瘤乏氧程度的AUC 分別為0.864，0.883。其中，靜脈期λHU的曲線下面積（area under the curve，AUC）較高，診斷閾值為1.3，相應(yīng)的靈敏度和特異度分別為85.7%和100%（表2、圖2）。

討 論

乏氧在實體腫瘤中普遍存在，實體腫瘤內(nèi)乏氧細胞的產(chǎn)生導(dǎo)致腫瘤對放、化療治療的抵抗作用，影響 患者治療及預(yù)后［8］。乏氧微環(huán)境改變會體現(xiàn)在腫瘤的血液供應(yīng)及腫瘤微細結(jié)構(gòu)的改變上。本研究結(jié)果顯示：強乏氧組腫瘤組織的能譜CT 定量參數(shù)靜脈期NIC 及靜脈期λHU顯著高于弱乏氧組，并且強乏氧組腫瘤組織在HIF-1α表達及MVD 計數(shù)上同樣比弱乏氧組表現(xiàn)出更高水平。

表1 能譜CT定量參數(shù)及腫瘤長徑在不同乏氧程度兔VX2移植瘤中的差異

表2 能譜CT定量參數(shù)預(yù)測兔VX2肺移植瘤乏氧程度的ROC曲線分析結(jié)果

圖1 兔VX2肺移植瘤能譜CT圖像A.動脈期70 keV CT圖像（CT值為88.62 HU）；B.動脈期碘基物質(zhì)圖像（碘濃度為1.63 mg/cm3，標準化碘濃度為0.15）；C.動脈期能譜曲線（斜率為1.90）；D.靜脈期70 keV CT圖像（CT值為82.76 HU）；E.靜脈期碘基物質(zhì)圖像（碘濃度為1.13 mg/cm3，標準化碘濃度為0.17）；F.靜脈期能譜曲線（斜率為1.16）。

圖2 靜脈期NIC及靜脈期λHU預(yù)測腫瘤乏氧程度的ROC曲線NIC為標準化碘濃度；λHU為能譜曲線斜率；VP為靜脈期。

能譜CT 定量參數(shù)靜脈期NIC 在不同乏氧程度腫瘤內(nèi)部存在顯著差異，這可能與腫瘤的血供改變有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，強乏氧組腫瘤內(nèi)MVD 較弱乏氧組腫瘤內(nèi)MVD 顯著增高，其可能的原因是，乏氧會導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部生物學(xué)特性改變，促使腫瘤生長，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，乏氧微環(huán)境會導(dǎo)致腫瘤組織HIF-1α 及VEGF 的增多，并促使新生血管增多，以增加腫瘤的血液供應(yīng)［9］。HIF-1α 在腫瘤內(nèi)部乏氧微環(huán)境中同樣有著重要作用，F(xiàn)an 等［10］研究直腸癌中的乏氧情況，探究分子標志物HIF-1α 與能譜CT 碘濃度之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)直腸癌腫瘤組織內(nèi)的HIF-1α表達與NIC具有顯著的正相關(guān)性。

能譜曲線能夠在一定程度上反映組織間的成分和結(jié)構(gòu)的差異，能譜CT 定量參數(shù)靜脈期λHU在不同乏氧程度腫瘤內(nèi)部存在顯著差異，這可能與不同乏氧程度腫瘤組織結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)。有研究表明，乏氧會影響細胞外基質(zhì)的沉積、重組和降解，HIF-1α 表達升高能夠誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2 的表達，從而影響細胞外基質(zhì)的生成和降解，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)重構(gòu)，改變腫瘤微環(huán)境的結(jié)構(gòu)特征，加劇癌癥的轉(zhuǎn)移［11-12］。這些均表明乏氧程度增加會影響腫瘤組織結(jié)構(gòu)，并在能譜CT成像參數(shù)中有所體現(xiàn)。

ROC 曲線分析結(jié)果顯示靜脈期λHU區(qū)分腫瘤乏氧程度具有較好的診斷效能，AUC 為0.883，診斷閾值為1.3，靈敏度為85.7%，特異度為100%，而靜脈期NIC 的AUC 為0.864，診斷閾值為0.17，靈敏度為78.6%，特異度為72.7%。由于HIF-1α升高會導(dǎo)致腫瘤細胞外基質(zhì)重構(gòu)，影響腫瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而腫瘤血管生成會促進腫瘤增生增殖，腫瘤內(nèi)血管結(jié)構(gòu)較紊亂，血管功能異常，紊亂的血管結(jié)構(gòu)可能使得NIC在區(qū)分乏氧程度時效能降低。

本研究存在一定的不足之處。首先，研究樣本較小，總體樣本量有待進一步加大。第二，采用動物實驗進行腫瘤成像研究，與人體自發(fā)腫瘤之間存在差別，有待進一步深入分析人體腫瘤乏氧程度來證實能譜CT 定量參數(shù)的應(yīng)用價值。第三，盡管實驗盡量保持動物標本與成像檢測部位的一一對應(yīng)關(guān)系，但誤差依舊難以完全避免。

綜上所述，能譜CT定量參數(shù)靜脈期NIC及λHU可為預(yù)測腫瘤乏氧程度提供一定的參考，這對臨床制訂腫瘤個體化治療方案及療效評估具有潛在的指導(dǎo)意義。