益氣活血方對大鼠心肌梗死后心肌肥大的影響及作用機制

魏路路 郭書文 馮鵬飛 王惠 黃琦惠 劉云柯 魏梵域

心肌梗死是由于持續性缺血和缺氧而引起的心肌壞死疾病[1]，是導致全球范圍內心血管疾病高死亡率的主要因素[2]。心肌肥大作為心肌梗死后的適應性反應[3]，是誘發心力衰竭的主要風險因素[4]，因此防治心肌肥大是治療心肌梗死的重要方向。細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是促分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的重要組成部分，可促進心臟生長[5]，參與心肌肥大的發生與發展[6]。課題組常用研究組方益氣活血方在前期研究中顯示能夠抑制大鼠心肌梗死后的心室重構，本研究重點觀察益氣活血方對心肌梗死大鼠心肌肥大相關指標的影響，并探究其是否與細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠50只，體重200～220 g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)2016-0006，飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，飲食由動物房提供。

1.2 藥物的制備

益氣活血方由生黃芪30 g、當歸15 g、人參10 g、三七6 g、川芎15 g組成，購買于北京中醫藥大學國醫堂門診部(該藥已申請專利，申請號為201610368030.7)。由中日醫院藥劑科制備，按照口服劑制作工藝，按處方稱取中藥材，加9倍量水，煎煮2次，每次2.5小時，共5小時，水煎液過濾、濃縮，調整濃度為1∶2(每毫升溶液對應生藥0.82 g)，分裝于100 mL玻璃瓶，滅菌備用。

對照藥酒石酸美托洛爾片，阿斯利康制藥有限公司，國藥準字H32025391，生產批號：1805A23，規格：25 mg×20片。

1.3 模型的建立

采用結扎左冠狀動脈前降支(left anterior descending，LAD)的方法制作急性心肌梗死動物模型。動物麻醉選用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射，麻倒后仰臥位固定于鼠板，剃毛備皮，行氣管插管，連接小動物呼吸機。定位左側第三、四肋間橫向剪開皮膚及肌肉，撕開心包膜，充分暴露心臟，以冠脈主干為標志，在左心耳下2 mm處用5/0無菌帶線縫合針結扎LAD。以結扎部位及以下區域變白為結扎成功的標志。將心臟復原，關胸縫合，脫離呼吸機，盡快恢復自主呼吸。假手術組僅將手術線穿過LAD，不結扎，其余步驟同模型組相同，手術過程嚴格無菌操作。以術后30分鐘心電圖ST段抬高并且24小時心電圖出現5個以上病理性Q波為造模成功的標志。

1.4 分組及給藥

用隨機數字表法將造模成功的大鼠隨機分配，分為模型組、益氣活血藥組、酒石酸美托洛爾組，另設假手術組，每組9只。干預治療7天后進行相關檢查。術后第2天給予相應藥物灌胃，益氣活血藥組[8.2 mg/(kg·d)]，酒石酸美托洛爾組[5 mg/(kg·d)]，模型組和假手術組給予等量蒸餾水，每日1次。

1.5 檢測指標

1.5.1 超聲檢測左心功能指標 采用影像Vevo770高分辨小動物超聲系統(加拿大Visual Sonics公司)檢測左心功能指標，通過高頻探頭RMV716取左室短軸切面，獲得M型曲線并進行分析，連續取3個心動周期，計算平均值。主要參數為：左室射血分數(left venteicular ejection fraction，LVEF)、左室短軸率(left ventricular shortening fraction，LVFS)、左室收縮末期內徑(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)和左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)。

1.5.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 將心肌組織用4%多聚甲醛固定，24小時后取出固定材料進行常規包埋切片(4 μm)，行HE染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，中性樹脂封片，切片于全景掃描儀中觀察并采集圖像。用Image-Pro Plus軟件完成橫截面積、直徑和周長的測量。

1.5.3 免疫組化法檢測梗死邊緣區心房鈉尿肽的表達 石蠟切片脫蠟至水，將組織切片置于盛滿乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原修復緩沖液(pH 8.0)的修復盒中于蒸鍋內進行抗原修復，冷卻后放于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌，之后放入3%過氧化氫溶液，阻斷內源性過氧化物酶，畫圈，血清封閉，加入配置好的一抗，4°C孵育過夜，加入二抗，孵育辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，去除PBS溶液，加新鮮配制的二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)溶液顯色，蘇木素復染核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，于全景掃描儀中觀察并采集圖像。

1.5.4 免疫印跡法(western blot，WB)檢測梗死邊緣區蛋白表達情況 通過WB檢測各組大鼠梗死邊緣區心肌肥大相關指標心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、β肌球蛋白重鏈(β-mysion heavy chain，β-MHC)的蛋白表達情況。為進一步探究益氣活血方治療心肌肥大與ERK通路的關系，故僅予觀察益氣活血組、模型組與假手術組ERK1/2、磷酸化細胞外信號調節激酶1/2(phosphorylation extracellular signal-regulated kinase，p-ERK1/2)的蛋白表達情況。按照試劑盒的說明進行樣本蛋白的提取以及調配相應濃度凝膠，取50 μg樣本蛋白在SDS-PAGE凝膠上電泳，濃縮膠恒壓80 V約20分鐘，分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到凝膠底部，濕轉轉膜至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(轉模時間2小時)，轉移結束后將PVDF膜浸泡于WB封閉液中搖床輕搖1小時，加入經1%BSA/5%milk稀釋好的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入對應的二抗室溫輕搖50分鐘，再次TBST洗膜，最后將PVDF膜浸泡于ECL顯色液中1分鐘，暗室中曝光，顯影并定影，條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進行讀取，各組分別與內參β-action比較得到相對光密度值。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 益氣活血方對各組大鼠小動物超聲結果

模型組大鼠相較假手術組LVFS、LVEF均顯著降低(P<0.01)，LVIDs、LVIDd均顯著升高(P<0.01)。兩用藥組相較模型組LVFS、LVEF均顯著升高(P<0.01，P<0.05)，LVIDs、LVIDd均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2 益氣活血方對各組大鼠HE染色及橫截面積、直徑、周長的結果

HE染色結果顯示：假手術組心肌細胞排列整齊， 胞核位于細胞中央， 未見炎性細胞浸潤。模型組細胞形狀不規則，排列紊亂，胞核游離，細胞間隙變大，伴隨炎性細胞浸潤。兩用藥組相較模型組，排列相對整齊，細胞間隙變小，胞核游離情況減輕，見圖1。

表1 益氣活血方對各組大鼠小動物超聲結果

梗死邊緣區心肌細胞的橫截面積、直徑和周長結果如表2所示。與假手術組相比，模型組心肌細胞橫截面積、直徑和周長均顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，兩用藥組三者均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌細胞HE染色比較(×400)

表2 益氣活血方對各組大鼠心肌細胞橫截面積、 直徑和周長的結果比較

2.3 益氣活血方對各組大鼠免疫組化檢測梗死邊緣區ANP的表達結果

假手術組心肌細胞排列整齊且清晰，模型組ANP陽性表達主要在細胞質和細胞核中，可見大片棕褐色顆粒聚集成片，少量細胞核淡藍色表達。兩用藥組相較模型組呈少量ANP表達陽性，表達部位呈淺染或深染的棕色顆粒，見圖2。

圖2 各組大鼠ANP蛋白的表達結果(標尺=50 μm)

2.4 益氣活血方對各組大鼠梗死邊緣區心肌肥大指標ANP、β-MHC蛋白的表達

檢查各組大鼠梗死邊緣區心肌肥大指標ANP、β-MHC蛋白的表達情況顯示：與假手術組相比，模型組的ANP、β-MHC蛋白均顯著提高(P<0.01)；與模型組相比，兩用藥組的ANP、β-MHC蛋白均顯著下降(P<0.01)，見表3、圖3。

表3 益氣活血方對各組大鼠ANP、β-MHC蛋白 表達比較

注：J為假手術組；M為模型組；Y為益氣活血組；MT為美托洛爾組

2.5 益氣活血方對各組大鼠梗死邊緣區心肌細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達

檢查心肌細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達情況顯示：與假手術組相比，模型組的p-ERK1/2蛋白顯著升高(P<0.01)，ERK1/2蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組相比，益氣活血組的p-ERK1/2蛋白顯著降低(P<0.01)，ERK1/2蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖4。

表4 益氣活血方對各組大鼠梗死邊緣區ERK1/2、 p-ERK1/2蛋白的表達比較

注：J為假手術組；M為模型組；Y為益氣活血組

3 討論

心肌梗死發生后，為了補償功能性心肌細胞的損失，心臟會發生一系列的結構改變來完成重構[7]。心室重構的潛在機制是多因素的，如氧化應激、炎癥、肥大和纖維化[8]。肥大和纖維化是進行性心臟病的早期指征，增加了心力衰竭、復發性心梗、心律不齊和猝死的風險[9]。益氣活血方是治療胸痹的經驗方，臨床上取得了良好的療效。課題組的前期研究發現[10-11]，益氣活血方能夠很好的延緩纖維化，增強抗氧化能力，抑制細胞凋亡和壞死，從而防治心肌梗死后的心室重構。本研究重點觀察益氣活血方對心肌梗死后心肌肥大的影響，并探究其可能的作用機制，為了更直觀的對比該方的療效，選用酒石酸美托洛爾作為對照藥。

本研究通過結扎左冠狀動脈前降支的方法制作了心肌梗死大鼠模型，并進行了超聲和HE染色以及心肌肥大特應性指標如心肌細胞橫截面積、直徑、周長的測量，模型組與假手術組相比，LVIDs、LVIDd、橫截面積、直徑、周長都顯著增高，EF、FS顯著降低，反映出心梗模型的建立是成功的，并且發生了心肌肥大的適應性改變。益氣活血藥組與模型組的對比證明益氣活血方能夠改善心肌梗死后的心肌肥大狀況，減輕心室重構。

ANP是心臟分泌的一種肽激素，屬于利鈉肽家族的一員[12]。ANP的主要功能為利鈉、利水和舒張血管，能夠維持水鹽平衡。當心肌細胞承受更高的血流壓力時，它會上調血管緊張素的表達，從而釋放出更多的ANP，導致心肌肥大的發生[13]，因而ANP常被看做心肌肥大的標志基因。β-MHC是肌球蛋白的基本成分，可為肌肉收縮提供動力。心肌肥大時常常伴隨著β-MHC的上調[14]。β-MHC表達的上升與ANP的過表達常被看做心肌肥大的標志。本研究中模型組的ANP和β-MHC的表達相較假手術組均顯著升高，這與CHEN等[15]的研究是一致的。益氣活血藥組與模型組相比，益氣活血方能夠降低心肌肥大的程度，抑制ANP和β-MHC蛋白的表達。

心肌肥大是心臟在受到有害刺激時為了維持心輸出量而進行的適應性和代償性改變[16]。主要分生理性肥大和病理性肥大兩種，前者是心臟在面對外來刺激時做出的順應性改變，對機體是無害的，后者是面臨病理刺激時發生的不可逆的適應不良性肥大。ERK信號通路是最重要的信號轉導途徑之一，它能夠調節細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物反應[17]，ERK通路的激活參與生理性和病理性肥大[18]。本研究通過對ERK1/2與p-ERK1/2蛋白表達的檢測，發現模型組中磷酸化ERK1/2蛋白較假手術組顯著增高，說明ERK1/2信號通路在模型組被激活，而益氣活血藥組可顯著降低磷酸化的ERK1/2蛋白，因此我們推測益氣活血方改善心肌梗死后的心室肥大可能與抑制ERK1/2信號通路有關。