二甲雙胍聯合抗阻運動對糖尿病大鼠下丘腦TGF-β1-Smad2/3的影響①

江秉澤 余思慧 張蘊南 紀夢迪 李佳欣 韋娟

(南京體育學院運動健康學院 江蘇南京 210014)

糖尿病作為慢性非傳染性疾病具有高發病率、高致死率、高致殘率的特點，其中2型糖尿病（Diabetic Mellitus，DM）占據糖尿病患者的多數。機體臟器的胰島素抵抗是產生2型糖尿病的重要原因[1]，下丘腦是神經內分泌的調控中心，可以通過直接和間接調控維持血糖的穩定，維持內環境的穩態。下丘腦的腹內側核和腹外側核與攝食飲水有著重要的聯系，糖尿病患者常出現多飲、多食、多尿、體重減輕的“三多一少”現象[2]。張曉明對糖尿病大鼠下丘腦切片染色，發現糖尿病大鼠下丘腦線粒體嵴消失，神經元之間突出結構蛻變，提示高糖環境下丘腦纖維化損傷嚴重[3]。

轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一組與細胞生長分化相關的細胞因子，在機體受傷組織和愈合傷口、細胞分化能力高的組織較為常見。TGF-β在細胞中廣泛存在，但基本無生物學活性。TGF-β1與其受體結合后，下游蛋白Smad2/3發生磷酸化，與Smad4結合形成異源復合體，轉位進入細胞核調控機體生長修復、組織纖維化等[4]。

二甲雙胍和運動作為常見改善糖尿病血糖干預措施，能有效提高外周血糖利用率，提高細胞外胰島素受體敏感性[5-6]。但關于藥物聯合抗阻運動對糖尿病大鼠下丘腦損傷的研究較少，該研究利用糖尿病大鼠模型，檢測抗阻運動和二甲雙胍干預對下丘腦TGF-β1、Smad2/3蛋白表達影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要試劑

TGF-β1、Smad2/3抗體（Proteintech Group，Rosemont），血糖儀（德國羅氏診斷有限公司）、高速離心冷凍機（美國BEKMAN COULTER）。

圖1 抗阻訓練運動負荷圖

圖2 血糖變化趨勢圖

1.1.2 實驗動物

SD雄性大鼠，體重（145±15）g，購自浙江省實驗技術中心。大鼠飼養環境，晝夜自然節律變化，溫度（20±3）℃，相對濕度55%～75%，大鼠自由攝食飲水。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模

50只SD雄性大鼠為期1周適應性飼養后，隨即抽取10只為正常對照組。以普通飼料喂養，自由進食飲水，自由活動，無運動干預。其余40只隨機分成4組，糖尿病組、藥物組、抗阻運動組、藥物聯合抗阻運動組進行糖尿病建模。高脂飼料喂養4周后，SD雄性大鼠停止飲食，不禁止飲水，以35mg/kg體重腹腔注射1%SZT注射液。對照組大鼠一次性注射同劑量的檸檬酸緩沖液（pH=4.4）。

正常組（NC組）自由活動，正常飼料喂養，每日7.5ml/kg的雙蒸水灌胃1次；糖尿病組（D組）自由活動，高糖高脂飼料喂養，每日7.5ml/kg的雙蒸水灌胃1次；藥物組（M組）自由活動，高糖高脂飼料喂養，300mg/（kg·d）的份量與7.5ml/kg雙蒸水制成二甲雙胍懸濁液進行灌胃1次；抗阻訓練組（P組）抗阻訓練，6周×6次/周；2組/d；3次/組，次間休息1min，組間休息2min。運動負荷如圖1所示。

1.2.2 指標的測定

大鼠飼養5周后測定血糖水平，腹腔注射1%的鏈脲佐菌素和檸檬酸紅沖液72h后再測定空腹血糖值，血糖值≥16.7mmol/L認為造模成功，造模1周后進行空腹血糖的復測，以確保糖尿病模型的成功。造模成功后實施分組干預方案，每2周為周期進行空腹血糖檢測直至實驗結束。

干預結束后，所有大鼠禁食禁水48h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，解剖取血后，將大鼠顱骨沿正中剪開，暴露全腦，在冰盤上迅速剝離下丘腦，將下丘腦組織放入2cm的含有編號凍存管中放入液氮中保存，后移至-80℃冰箱保存備用。從上述大鼠中提取下丘腦組織存于-80℃冰箱，每個樣本取0.1g大鼠下丘腦組織，使用碧云天RIPA裂解液提取蛋白、根據Thermo Scientific的BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。調節蛋白濃度為5μg/μl，經5×loading buffer稀釋后，蛋白濃度為4μg/μl，上樣量為15μl，聚丙烯凝膠電泳分離蛋白后，轉移到PVDF膜。快速封閉液封閉15min，一抗過夜，次日TBST洗膜3次，5min/次。二抗孵育，結束后TBST洗膜3次，5min/次。洗凈后，ECL化學發光液孵育3min，使用數碼凝膠成像分析系統顯影，Image lab分析條帶灰度值。

1.2.3 數據統計

所有數據均用JMP 14.0統計軟件進行統計，各數據用均值±標準差（）的形式表現，組間比較應用t檢驗，多組之間比較采用雙因素方差分析進行統計，以P＜0.05作為差異顯著性的界值。

2 結果

2.1 血糖

如圖2所示，造模前各組內無明顯差異。2周后M組與D組比較，血糖水平顯著下降（P＜0.05），P組血糖有所下降，但無統計學意義（P＞0.05），MP組血糖顯著降低（P＜0.01），M組和MP組無明顯差異(P＞0.05)。4周后，M組與D組對比，血糖水平顯著下降（P＜0.05），MP組較D組血糖顯著下降（P＜0.01），MP組較M組，降血糖效果降低（P≤0.05），P組血糖水平下降，無統計學差異（P＞0.05）。6周后，M組血糖水平對比D組有所下降，P組血糖下降（P＜0.05）。MP能夠顯著降低糖尿病血糖（P＜0.01），但降血糖水平低于單純藥物干預（P＜0.05），P組和MP組血糖值無明顯差異（P＞0.05）。縱向比較，隨著藥物干預時間的延長，降血糖效果無顯著性差異（P＞0.05），隨著運動干預時間的延長，降血糖效果無明顯差異（P＞0.05），隨著聯合干預的時間的延長，第6周降血糖水平較第4周下降較為明顯（P＜0.05）。

圖3 Western-blot檢測各組大鼠TGF-β1-Smad2/3蛋白表達

2.2 Western-blot結果

如圖3、圖4所示，結果顯示糖尿病組大鼠下丘腦TGF-β1高于正常組，但無統計學差異（P＞0.05），藥物組和抗阻組TGF-β1略低于糖尿病組，但仍高于正常組，且均無統計學差異（P＞0.05），藥物聯合抗阻運動組TGF-β1表達量略低于糖尿病組，但高于抗阻組，無統計學差異（P＞0.05）。Smad2糖尿病組表達量較正常組升高，抗阻組和藥物組均有一定的升高，抗阻聯合藥物組升高趨勢最為明顯，但無統計學差異（P＞0.05），Smad3各組之間無明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

抗阻訓練作為常用的訓練方式，可以多方面訓練軀體的肌肉群，增加肌肉對血糖的攝取利用，增加胰島素受體的數量和敏感性[7]，起到降低血糖的作用。二甲雙胍作為一種常用的臨床藥物，通過AMPK途徑激活PKC，調控下游蛋白發生磷酸化，抑制肝臟糖異生和促進外周組織對血糖的攝取利用。該研究發現，運動訓練和二甲雙胍單獨干預均可以使糖尿病大鼠血糖水平下降[8-9]，這與以往研究一致。該研究發現，二甲雙胍藥物干預2周后，M組血糖水平明顯低于D組；抗阻訓練干預后，在6周訓練前血糖水平無明顯的改變，提示抗阻運動對糖尿病大鼠的血糖降低效果與持續訓練的周期有著密切的聯系，至少要持續6周的負重抗阻訓練才能起到降血糖的作用。與預期相反，抗阻運動和二甲雙胍聯合運動對糖尿病大鼠血糖的調控效果相似，隨著運動周期的延長，甚至有所下降，提示運動和二甲雙胍對血糖降低可能存在一定的拮抗作用。沈文清認為[10]，這種抑制作用可能是運動干預抑制了二甲雙胍藥物動力學活性，同時二甲雙胍抑制了線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性，且運動本身會加強肝糖原釋放，補充運動過程中血糖的消耗，血糖上升，這種運動血糖上升的機制與二甲雙胍降血糖的作用相悖，所以降低了二甲雙胍的降血糖效果。此外，二甲雙胍可以通過對三羧酸循環中關鍵酶的調節，降低線粒體ROS水平[11]，但運動過程中，能量消耗增加，線粒體氧化磷酸化水平增加，ROS產生增多[12]。與上述結論相反，黃安華[13]發現1年抗阻運動結合二甲雙胍服用，可以有效地改善胰島素抵抗指數，對血糖水平也有著明顯的改善作用。沈文清[14]發現急性運動結合二甲雙胍干預較單獨干預能夠更加顯著地改善2型糖尿病小鼠血糖穩態和肝臟糖異生情況。對于這種不同的現象，可能與二甲雙胍服用的劑量、藥物服用與運動的間隔時間、運動的方式、運動劑量密切相關。把握運動強度和藥物服用的時間，逆轉兩者疊加的抵消作用是藥物治療和運動治療結合的關鍵之處。

TGF-β1是Smad2/3的上游蛋白，與器官的纖維化有著密切的聯系。在高糖環境下，各器官臟器都出現了纖維化的現象，器官的形態和功能都受到了嚴重的影響。張曉明[3]對糖尿病大鼠的肝臟、腎臟和下丘腦等組織進行了染色切片，發現上述器官的纖維化水平對照正常大鼠明顯加劇。與以往實驗結果相反，此實驗通過Westernblot的方式對蛋白表達量進行檢測發現，D組大鼠下丘腦TGF-β1、Smad2/3表達水平與C組均無明顯差異。此外，分別將P組、M組和MP組與D組進行比較，發現各組之間的TGF-β1和Smad2/3蛋白表達量無明顯差異。施若黎[15]研究發現，大鼠高脂飼料喂養后，15mg/kg劑量2次腹腔注射2%SZT注射液建模，染色切片發現下丘腦纖維化程度嚴重，糖尿病大鼠TSP-1、TGF-β1表達量上調。實驗大鼠以35mg/kg腹腔注射1%SZT注射液建模，D組和C組TGF-β1、Smad2/3蛋白尚未發現差異，提示糖尿病器官損傷可能和建模STZ注射劑量相關。修賢杰[16]認為小劑量的STZ多次注射聯合高糖高脂飲食是較佳的糖尿病大鼠建模方式，較好地模擬了糖尿病代謝特征和進展過程，而一次性大劑量注射可能會引起胰島細胞的過度損傷，糖尿病大鼠成模率下降，死亡率提高。同批次大鼠的心肌的TGF-β1表達量進行檢測[17]，發現D組和P組發生顯著性提高，與D組相比，M組、P組MP組的蛋白表達量卻明顯下降。由此推測，高糖環境對于同一個體的不同器官的毒害進程存在時間順序，《中國糖尿病指南》依照糖尿病腎病進展，將糖尿病分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四期，隨著糖尿病進程逐漸加劇，推測糖尿病下丘腦損傷也存在時間進程的差異，由于實驗條件的限制，未對該批糖尿病大鼠下丘腦染色切片，觀察下丘腦損傷程度。尚不能認為此實驗6周高糖環境對下丘腦造成損傷。

圖4 TGF-β1、smad2/3條帶圖