粘紅酵母降解酚酸自毒物質效能及在西瓜根部定殖研究

王桂蓮,李 敏,2,王 靜

(1.北方民族大學 生物科學與工程學院,寧夏 銀川 750021;2.北方民族大學 寧夏葡萄與葡萄酒技術創新中心,寧夏 銀川 750021)

近年來,由化感自毒作用誘發的連作障礙成因及治理是農業科學領域研究的熱點問題之一[1-2].化感自毒作用指作物向周圍環境(主要是土壤介質)釋放出化學物質,該類化學物質的累積會對同茬或下茬作物的生長產生負面影響[3].對西瓜多年連作土壤進行研究發現,阿魏酸、香豆酸、香草酸等酚酸類物質是存在于根系土壤中的主要自毒物質[4-7].酚酸是一類苯環上帶有活性羧酸基團的小分子有機酸,在植物體內可通過莽草酸途徑合成[8].自然條件下,該類物質通過雨露淋溶,根系分泌和殘體腐解等形式進入周圍環境,積累到一定量時即對植物產生顯著的化感自毒作用.

在自毒物質的防治領域與輪作、嫁接和增施有機肥等措施相比,向土壤中添加有益微生物降解賦存于作物根系的自毒物質,是一種更為徹底有效的防治措施.其中,獲得能夠在作物根系定殖的酚酸類物質高效降解菌株是關鍵的技術環節之一.本文以粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)為生物材料,研究其對西瓜根系主要自毒物質阿魏酸、p-香豆酸、香草酸和丁香酸的降解效能,并探明該菌在西瓜根部的定殖能力,以期為該菌進一步應用于酚酸類自毒物質的防治奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

阿魏酸、香豆酸、香酸草、丁香酸、利福平、二甲基亞砜等藥品購自阿拉丁試劑(上海)有限公司,均為分析純(≥98%).氯化汞(上海廣諾化學科技有限公司).色譜分析用甲醇為色譜純(Sigma-Aldrich);超純水(電阻率大于18 MΩ·cm)由實驗室純水儀制備.

西瓜種子(金城5號)為寧夏中衛香山硒砂瓜主要栽培品種.

粘紅酵母A3為本實驗室保存菌種.

1.2 降解效能定量測定

將甘油凍存菌株接種至Luria-Bertani(LB)液體培養基,30 ℃,150 r/min培養至對數生長期后,取一定體積菌液離心,棄去上清液后用無菌水制備成菌懸液.將菌懸液加入含50 mg/L酚酸的降解培養基(培養基配置參照文獻[9]),使培養基中菌細胞初始濃度達到108CFU/mL,于150 r/min恒溫搖床中振蕩培養,定時取樣測定培養基中菌細胞數量和酚酸濃度.菌細胞數量采用紫外-可見分光光度計680 nm處的吸光度值定量表征.酚酸化合物定量分析采用高效液相色譜儀(Agilent 1200)串聯二極管陣列檢測器(DAD,G1315B),色譜柱為Agilent ZORBAX RX-C18、4.6×150 mm、5μm;液相色譜條件為：流動相為甲醇-0.1%乙酸溶液(50/50,v/v),流速 0.5 mL/min,進樣量：10 μL;其中,阿魏酸檢測波長320 nm,保留時間4.136 min;丁香酸檢測波長285 nm;保留時間3.525 min;香草酸檢測波長260 nm,保留時間3.559 min;香豆酸檢測波長306 nm,保留時間4.046 min.

1.3 A3R在西瓜根系土壤中的定殖

1.3.1 菌株A3的利福平(Rifampicin,以下簡稱 Rif)抗性標記

采用包含Rif漸進濃度分別為5,10,20,40,60,80,100,200和300 μg·mL-1的LB培養基逐級馴化菌株A3,直至獲得能夠耐受300 μg·mL-1Rif,且對酚酸類物質降解性能不變的突變菌株A3R.取A3R單菌落,接種于不含Rif的LB培養基,30℃,150 r/min-1恒溫振蕩培養12 h,取培養液再接種于不含Rif的LB培養基中,相同條件下繼續培養,如此重復至96 h后,取100 μL培養液,涂布于無Rif的LB平板上,隨機選取100個單菌落轉入含300 μg·mL-1Rif的抗生素平板,以抗性菌株所占百分比計算標記菌株A3R的遺傳穩定性.

抗性標記菌株A3R的降解效能測定參照1.2中的要求.

1.3.2 標記菌株A3R在土培西瓜根部的的定殖檢測

清洗西瓜種子,用無菌水浸泡6 h后,采用0.01 g/L氯化汞溶液處理8 min,再用無菌水漂洗6次,將種子放入無菌培養皿中的濕濾紙床中,在28 ℃黑暗環境培養至種子露白.將露白種子轉移至裝有滅菌栽培土的育苗盆中,在種子附近施1 mL濃度為1×108cfu/mLA3R菌液,等量無菌水為對照,然后覆蓋厚度為1 cm的滅菌栽培土.每個處理3個平行.移至光照培養箱培養,培養條件28 ℃,光周期12 h光照/12 h黑暗.培養7 d后第一次采樣,之后每隔4 d取樣1次,每次取3株,連續取7次,參照王靜[10]方法分別取根際土和根表土測定標記回收菌株A3RC,換算定殖密度.

標記回收菌株A3RC的降解效能測定參照.

2 結果與分析

2.1 菌株A3對酚酸類化合物的降解效能

4種酚酸化合物的分子結構信息如表1所示,菌株A3對它們的降解性能如圖1所示.實驗結果顯示,菌株A3對p-香豆酸、阿魏酸和香草酸表現出較高降解能力,經6～8 h后降解率可達98%以上;而菌株對丁香酸的降解能力最弱,經22 h后體系中仍有50%的丁香酸殘留.對比p-香豆酸和阿魏酸的分子結構發現,二者除了苯環3號位取代基不同外,其余結構均一致;其中,前者3號位無取代基,后者3號位有甲氧基取代基,因此推測甲氧基的存在對菌株A3轉化利用該類化合物略有阻礙作用.對比阿魏酸和香草酸的分子結構發現,二者除苯環1號位取代基類型不同外,其余結構均一致;其中,前者1號位為丙烯酸基團,后者為羧基,由此推測苯環1號位為丙烯酸基團,有利于菌株A3的降解轉化.丁香酸苯環3、4和5號位分別存在甲氧基、羥基和甲氧基,推測上述取代基的存在限制了菌株A3對其的降解效能.綜上可知菌株A3對4種化合物降解轉化效能的強弱與分子結構特征密切相關.

表1 4種酚酸化合物分子結構信息

圖1 菌株A3對酚酸底物的降解活性

2.2 菌株A3在西瓜根部的定殖

2.2.1 標記菌株A3R的篩選

逐步提高Rif濃度,獲得能夠在300 μg/mLRif LB培養基生長的標記菌株A3R,經不含Rif的LB 液體培養基連續轉接8次后涂布于LB培養基,隨機挑取100個菌落,發現其均可以在含有300 μg/mL Rif的LB培養基中正常生長,生長情況如圖2所示.可見標記菌株A3R的Rif標記穩定性強.

圖2 菌株A3R在含有300 μg/mLRif的LB平板上的生長情況

2.2.2 標記菌株A3R在西瓜根部的定殖能力

圖3 菌株A3R在西瓜根系土壤中的定殖動態

經A3R菌液澆灌西瓜種子,培養7 d后開始采樣測定標記菌株A3R在西瓜幼苗根際土和根表土中的含量,結果如圖3所示.第一次取樣(7 d)標記菌株A3R在根際土和根表土中的含量均達到最高,分別達 1.32×105cfu/g和2.94×104cfu/g;在培養7 d～19 d內,菌密度呈明顯下降趨勢;19 d后,菌體密度逐漸趨于穩定,分別維持在2.26×104cfu/g和7.04×103cfu/g左右.將從根際土和根表土中回收的菌株標記為A3RC,驗證回收菌株對酚酸化合物的降解性能.

2.2.3 菌株A3RC對酚酸化合物降解性能的驗證

考察菌株A3RC對4種酚酸化合物的降解性能,并與菌株A3及A3R進行比對,結果如圖4所示.各個降解體系中菌株A3,A3R及A3RC對酚酸的降解能力和菌體的生長狀況基本一致.采用統計學方法對各降解體系中酚酸化合物的殘留情況進行分析,對于阿魏酸(圖4(a))和p-香豆酸(圖4(b)),降解4 h后菌株 A3R和A3RC與原菌株A3存在顯著性差異(P<0.05),但降解6 h后差異消失;對于丁香酸(圖4(d)),降解2、4和6 h菌株 A3R和A3RC與原菌株A3存在顯著性差異(P<0.05),但其余組均無差異;總體而言,上述出現差異組的占比很小.可見標記菌株A3R和回收菌株A3RC與原菌株A3對4種酚酸化合物的降解效能一致.

圖4 菌株A3,Rif標記菌A3R和西瓜根系土壤定殖回收菌A3RC的遺傳穩定性檢測

3 討論

植物根系能夠向外分泌糖、氨基酸等多種營養物質,但同時亦能合成并分泌對自身有害的物質,引起化感自毒作用[11-13].已有研究發現假單胞菌(Pseudomonassp.)[14],葡萄球菌(Staphylococcussp.)[15],不動桿菌(Acinetobactersp.)[16],曲霉菌(Aspergillussp.)[17]等對酚酸類化合物表現出高效降解能力,此方面的成果尤以國內學者研究報道居多.Zhang[14]亦發現粘紅酵母菌(Rhodotorulaglutinis)經48 h對1 g/Lp-香豆酸降解效率達70%～99%.但上述研究均聚焦于降解速率的檢測,外界環境因素對降解效能的干擾,未能關注到有益微生物在植物根部土壤中大量定殖,是其在自然環境中發揮降解轉化自毒物質作用的先決條件.本研究以實驗室保存菌株粘紅酵母A3為生物材料,研究發現其對p-香豆酸、香草酸、阿魏酸具有高效降解能力,對丁香酸的降解效果較弱.通過抗生素利福平Rif標記菌株A3后進行定殖實驗,結果顯示施加A3R菌株26 d后,標記菌株A3R在根際土和根表土的定殖密度分別為105和104cfu/g,推測A3R在西瓜根系定殖成功.本研究結果發現粘紅酵母菌A3在酚酸類物質積累的連作土壤修復領域具有潛在應用價值,值得進一步研究開發.