天祝白牦牛不同時期卵巢中Fas和FasL的表達變化

羅文學,阿依木古麗,韓郁茹

(1.天祝縣畜牧技術推廣站，甘肅 天祝733299，2.西北民族大學生命科學與工程學院)

1 Fas基因與fasl的關系

Fas基因，又稱APO-1、CD95，最早在90年代被遷本(Tsujitomo)發現的促細胞凋亡因子。Fas基因是由編碼325個氨基酸組成的蛋白質，為腫瘤壞死基因超家族的成員(TNF-6)。Fas是一種分子質量約為48 ku的I型跨膜蛋白，廣泛分布于人和動物機體的各組織中。

FasL，即Fas配體，是Ⅱ跨膜蛋白，相對分子質量約為40 ku。Fas和FasL二者在淋巴細胞的生長、發育、成熟、分化和免疫應答的過程中發揮重要作用。當Fas與FasL結合后，將導致Fas發生寡聚反應，進而引起細胞內死亡誘導信號復合體(DISC)的組裝，該復合體通過激活起始caspase引發一系列有關酶的級聯反應，最終導致Fas細胞凋亡。目前研究表明Fas和FasL通過介導細胞凋亡在腫瘤發生、自身免疫性疾病和感染性疾病等中起著重要的調控作用。研究表明卵泡閉鎖發生于卵泡發育的任何時間內，并且逐步進行，多是相鄰囊狀較小的卵泡先發生閉鎖。Fas作為細胞凋亡基因，探究其在卵巢不同發情周期中的信號轉導作用，通過熒光定量RT-PCR技術進行生物學信息分析，為天祝白牦牛卵巢閉鎖系統調節機制提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 實驗對象

本實驗以健康天祝白牦牛的母牦牛作為實驗對象。分別屠宰處于卵泡期、懷(10～30 d)、懷孕(40～60 d)、懷孕(70～90 d)、黃體期、乏情期的健康母牦牛，用無菌手術剪采集卵巢，用液氮保存并帶回實驗室進行mRNA熒光定量分析實驗。

2.2 實驗試劑與實驗器材

實驗試劑：TRIZOL試劑、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒(試劑盒組分①5×Reaction Buffer②dNTP Mix(10mmol/L)③Oligo dT Primer(0.5μg/μL)④Random Primer p(dN)6(0.2μg/μL)⑤Rnase lnhibitor(20U/μL)⑥M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μL)(生工生物工程(上海)股份有限公司)⑦Rnase -free ddH2O)、 氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase-free ddH2O、瓊脂糖、1×TAE、核酸染料。

實驗器材：臺式高速冷凍離心機、電熱恒溫水浴鍋、立式高溫壓力滅菌器、電子秤、電泳系統、凝膠數字成像系統、電泳槽、雙人單面循環凈化工作臺、超低溫冰箱、基因擴增儀、移液槍、高壓滅菌后的槍頭、離心管、渦旋振蕩器、PCR管、酒精燈、鑷子、制冰機、電泳槽、錐形瓶、量筒等。

2.3 總RNA提取與反轉錄

將研缽及研缽棒等器材用洗潔精洗凈后用蒸餾水沖洗干凈，晾干并放入電熱恒溫干燥箱中280℃、30 min，以除去研缽中的細菌等污染物。此外實驗過程中所用到的移液槍槍頭、離心管以及PCR管均需于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、20 min滅菌。當溫度降至室溫以后，取出實驗器材并晾干備用。

2.3.1 根據Trizol提取試劑法的說明書步驟進行操作 (1)將所需要的實驗器材和在-70℃冰箱中液氮保存的牦牛子宮組織，放置于超凈工作臺中。打開紫外燈將超凈工作臺紫外殺菌15 min然后打開吹風機再用燃燒的酒精棉球消毒臺面。雙手及袖子噴灑酒精消毒后進入工作區域，將酒精棉球點燃后用鑷子夾住，然后擦拭研缽以及缽棒，用以消毒研缽及缽棒。(2)待研缽表面溫度與室溫相同時，取適量液氮于研缽中，再取樣品組織于研缽中，用缽棒迅速研磨。在研磨期間需不斷補充液氮，直至組織研磨成白色的粉末狀并轉移至2 mL離心管中。(3)經液氮研磨后的卵巢組織按50～100 mg組織/mL Trizol提取試劑加入Trizol提取試劑后，室溫放置5 min，加200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，轉移至離心管。將離心管放入臺式高速冷凍離心機中，12 000 rmp/min，4℃，10 min。(4)取上層清液加入等體積異丙醇，室溫靜置20 min。再轉入臺式高速冷凍離心機，12 000 rmp/min，4℃，10 min。(5)棄去上清液，加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀。再離心，12 000 rmp/min，4℃，3 min。(6)棄去上清液后，室溫干燥5～10 min。(7)對沉淀進行濃度檢測，即采用無RNA酶的DNase Ⅰ(可加入適量加入適量RNA酶抑制劑)處理提取RNA中夾帶的DNA。具體操作如下表1所示：將混合物混勻，37℃放置90 min。(8)配制1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠，取(9)中的混合物4 μL，加入加入6×RNA電泳上樣緩沖液2 μL混勻，緩沖液2 μL混勻，再加入電泳槽加樣孔中。120 V，25 min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。電泳條帶可見28S和18S兩條明亮條帶，則無DNA條帶污染。加入30～50 μL RNase-free ddH2O將所得RNA溶解并置于-70℃中保存備用。

表1 RNA濃度檢測反應體系

2.3.2 根據生工生物工程(上海)股份有限公司的M-MuLV Reverse Transcriptase(200 U/μL)的說明書進行操作 (將RNA反轉錄為cDNA) (1)反應需在冰浴中進行。檢查5* Reaction Buffer是否有結晶出現。在無結晶的情況下繼續進行如下操作。向試管總分別加入表2中反應物，試劑加入完畢后，用手輕輕混勻，并離心3～5 s。(2)反應混合物在65℃水浴中放置5 min， 然后在試管冰浴的過程中加入如表3中組分，輕輕混勻并離心3～5 s：(3)接著按如下表操作在PCR儀上進行反轉錄：再冰浴30 s，接著離心3～5 s，冰浴。(4)反轉錄合成cDNA后，取5 μL反應產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，經EB染色后再紫外染色。結果呈現出200～10 kb的拖帶，則其中心區域在1～4 kb之間，cDNA反轉錄結果安全。將產物于-20℃保存備用。

表2 反轉錄反應物

表3 反轉錄試劑

表4 cDNA的合成

2.4 引物設計與合成

根據NCBI數據庫中牦牛(Bos grunniens)β-action(GeneBank登錄號：DQ838049.1)、牦牛Fas(GeneBank登錄號：JN880421.1)和牦牛FasL(GeneBank登錄號：JN880420.1)基因的mRNA序列，采用Primer Primer5.0軟件對目的基因進行PCR引物設計并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過β-action作為內參基因來檢測天祝白牦牛發情周期不同階段卵巢Fas的表達變化。引物信息如表5。

表5 引物序列與Real-time PCR反應參數

引物序列及反應條件

2.5 目的基因熒光定量與RT-PCR擴增

熒光定量RT-PR反應體系(25μL)根據SYBR Premax Tag進行操作，反應體系的配制如下。

表6 熒光定量RT-PR反應體系

熒光定量RT-PR反應程序：預變性95.0℃、5 min，變性95.0℃、30 s，退火60℃(Fas)/60℃(FasL)/60℃(β-action)、20 s，延伸72.0℃、30 s，循環40次。分別在每個循環的退火和延伸階段采集熒光信號數據。待擴增結束后即進行溶解曲線分析，根據所得的溶解曲線判斷反應的特異性。再根據每個樣品的Ct值，用2-ΔΔCt法計算出目的基因的相對表達量。

2.6 數據分析

每個實驗樣品需重復3次。系統根據實時熒光定量RT-PR反應結果得出的溶解曲線計算出各個樣品中目的基因和內參基因含量的含量，并以同一樣品中目標基因的相對和內參基因含量的比值作為目標基因的相對表達量。所得出的實驗數據用SPSS 16.0統計分析軟件One-way ANOVA進行方差分析以及顯著性檢驗。結果用平均值、標準差表示，P<0.05時表明差異顯著，P>0.05時表明差異顯著。

3 結果

如圖1所示：Fas的表達含量在黃體期最高，其次為卵泡期。懷孕中期Fas表達含量很少，幾乎不表達。

圖1 Fas的表達含量

如圖2所示：FasL的表達含量在黃體期最高，其次為卵泡期。懷孕中后期FasL表達含量較少，但相對于Fas表達量較多。

圖2 Fasl的表達含量

4 討論

天祝白牦牛卵巢主要位于子宮闊韌帶前部的卵巢系膜邊緣處，為卵圓形的實質性器官。卵巢其形如黃豆，且卵巢門無凹陷。卵巢可分為外周的皮質和中央的髓質。皮質是卵泡發育的場所，故內含有不同發育階段的卵泡。而髓質中含有豐富的血管和結締組織，為卵泡的生長發育提供營養物質。卵泡的生長發育過程可分為原始卵泡、生長卵泡和成熟卵泡。在多數情況下，最終能發育到成熟且進入排卵階段的卵泡在整個卵泡發育體系中只占極少數。卵泡排卵后，卵泡壁塌陷，一方面卵泡壁內膜上的血管破裂出血形成紅體，另一方面殘留于卵泡內的顆粒細胞和內膜細胞分別形成粒性黃體細胞、膜性黃體細胞，二者均具有分泌功能，分別分泌孕酮和雌激素。卵巢作為內分泌腺，在卵泡期伴隨卵泡的發育，雌激素的合成與分泌逐漸增加，其在血液中的濃度逐漸上升，而孕激素相對處于較低水平。排卵后，隨著黃體的生成，血液中雌激素濃度下降，而孕激素含量顯著升高。在卵泡生長發育過程中，FSH和LH為其主要的蛋白質調節因子，它們通過與受體結合激活cAMP依賴性生理過程，進而促進了粒細胞和壁細胞類固醇激素生成酶的活性，血液和卵泡液中E2的濃度也隨之升高。此外卵泡細胞還可生成抑制素、催產素、松弛素活化素等，參與卵泡生長發育的調節。在自然條件下，多數卵泡都會隨著發育的進行逐漸退化成為閉鎖卵泡，而僅剩余的少數卵泡為優勢卵泡。

在天祝白牦牛妊娠早期，其卵巢可分泌顆粒且分泌顆粒可通過胞吐作用釋放到卵泡細胞中調節卵泡細胞的生長發育，并與早期妊娠密切相關。伴隨著發情周期的延續，卵巢發生周期性的變化。實驗結果表明，卵泡期、懷孕期10～90 d、黃體期以及乏情期過程中Fas和FasL均有表達。其中，Fas在黃體期mRNA相對表達含量最高，其次為卵泡期，在懷孕期間Fas的mRNA幾乎不表達，之后在乏情期含量顯著上升。FasL在黃體期的mRNA相對表達含量最高，在卵泡期的表達量也較高，再次為乏情期和懷孕(10～30 d)，懷孕(40～90 d)mRNA相對表達含量相對較少。但總體來說，天祝白牦牛不同發情周期卵巢FasL的mRNA相對表達含量相對Fas含量較高。表明，Fas和FasL凋亡通路參與調節牦牛卵泡細胞周期性的增值與調節過程，而且在其凋亡途徑中主要通過Fas的調控來實現。研究表明子宮內膜雌激素受體αmRNA和孕激素受體mRNA在發情周期后期相對表達含量最強、間情期相對表達含量最弱，雌激素可以降低牦牛子宮內膜細胞中Fas及FasL的表達。本試驗中在黃體期Fas和FasL表達顯著上升，此時血清雌激素水平降低。研究發現奶牛子宮內膜中ERαRNA和蛋白質都在卵泡期隨著血清雌激素水平升高而極顯著增加，雌激素可以上調其受體ERα的表達。此外，卵巢的卵泡閉鎖在黃體期細胞凋亡顯著升高，乏情期卵巢凋亡蛋白相關基因表達量降低，而在發情間期凋亡蛋白幾乎不表達。

5 結論

天祝白牦牛不同發周期卵巢中，Fas的相對表達含量在黃體期最高，懷孕期間幾乎不表達；FasL的相對表達含量在黃體期表達最高，而在卵泡期，懷孕期間相對表達含量逐漸降低，但表達量高于Fas。