大熊貓酶標孕酮的制備與檢驗

趙衛平，李 嬋，洪 金，林鵬飛,*，雷穎虎,*

(1.秦嶺大熊貓研究中心，陜西 周至 710402；2.西北農林科技大學)

大熊貓是我國特有珍稀動物，冠有國寶美稱，盡管被劃分為國家一級保護動物，其數量卻仍然增長緩慢。除了人為因素的影響，這還與其獨特的生理繁殖機制有關，大熊貓是單季節發情動物，發情時間短，僅有1～3 d，如何精準判斷大熊貓的發情期是提升大熊貓繁殖率的最關鍵一步。孕酮(Progesterone，P4)和雌激素(Estrogen)做為雌性動物發情時變化最為劇烈的兩種激素，且在動物尿液中就可檢測到，因此可作為大熊貓無侵入損害的一個檢測指標。

目前ELISA檢測技術已大量應用于激素檢測，HRP是ELISA試劑盒顯色體系的主要成分之一，其與抗原或者抗體結合可以形成酶標抗原或酶標抗體從而應用于ELISA試劑盒中。P4為半抗原，化學結構相對穩定，不能與HRP直接結合，需要用11α-OH-P4進行化學修飾后與HRP結合，因此本試驗旨在合成用于孕酮檢測的ELISA試劑盒的辣根過氧化物酶酶標的P4-HRP偶聯物，為后續開發大熊貓孕酮ELISA檢測試劑盒提供所需的酶標抗原。

1 材料與方法

表1 試劑及耗材

1.2 主要儀器

表2 試驗用儀器

1.3 方法

1.3.1 孕酮-半琥珀酸酯的合成 ①稱取5 g 11α-羥基孕酮(11α-OH-P

4)、5.96 g 琥珀酸酐與2.6 g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)于圓底燒瓶中，加入200 mL二氯甲烷，攪拌回流反應5 ～10 h；②薄層色譜反應(Thin layer chromatography，TLC)同時進行跟蹤反應進度，展開劑為V乙酸乙酯：V石油醚=10∶1；③待反應完全后，將反應液用60 mL二氯甲烷稀釋；④純化：反應液用10 mL去離子水萃取1次，10 mL 2 M 鹽酸萃取2次，最后用去離子水萃取2次；⑤干燥脫色：加入無水硫酸鈉干燥，活性炭室溫攪拌脫色，過濾得無色澄明液，減壓蒸盡二氯甲烷，干燥得到白色結晶產物，即為11α-羥基半琥珀酸酯(11α-OH-P4-HS)。

1.3.2 11α-OH-P4-HS的鑒定 (1)11α-OH-P4-HS的TLC鑒定反應至終點時，取少量反應液，進行TLC鑒定；(2)11α-OH-P4-HS的產率鑒定產率即合成反應中實際產物的量與理論值的比值。在此合成反應中，反應物 11α-OH-P4的物質的量與合成11α-OH-P4-HS的物質的量的比值根據公式①計算：

產率= n(11α-OH-P4)/ n(11α-OH-P4-HS)× 100%

(公式①)

1.3.3 孕酮酶標抗原的制備 ①取11α-OH-P4-HS 2.6 mg，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)0.9 mg和二環己基碳二亞胺(DCC)1.3 mg置于5 mL三角燒杯中，滴加0.15 mL二甲基甲酰胺(DMF)，混勻后4 ℃過夜；②次日發現有尿素衍生物結晶析出，說明已有孕酮衍生物的NHS活化酯形成；③取HRP 2 mg，用2 mL 0.1 M NaHCO3溶解，室溫下加活化酯2 μL攪拌，每10秒加2 μL，共10 μL。繼續攪拌8 h，用0.04 M pH 7.2的PBS 1 000 mL攪拌透析24 h，期間換液三次。

1.3.4 酶標抗原的鑒定 (1)免疫學鑒定①包被：5 ng/mL 的P4單克隆抗體加入酶標板，每孔100 μL，4 ℃過夜，倒出孔內液體，洗滌液洗3次，拍干；②封閉：每孔加封閉液200 μL，37 ℃ 2 h，棄封閉液，洗滌液洗3次，拍干；③抗原反應：11α-OH-P4、HRP以及產物，倍比稀釋為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800和1∶1 600，每孔100 μL，37 ℃ 60 min，棄反應液，洗滌液洗3次，拍干；④顯色：每孔加新鮮配制的底物溶液100 μL，顯色10～15 min；⑤終止：每孔加終止液50 μL；⑥讀數：在450 nm處測定光密度(OD)值。(2)紫外掃描鑒定將一定濃度的半抗原、載體蛋白以及偶聯產物利用紫外分光光度計在200 nm-400 nm處進行掃描，通過掃描波長的變化，判斷偶聯是否成功。(3)酶標記率采用超微量紫外分光光度計，讀取酶標復合物的 OD260 nm 值、OD280 nm值以及 OD403 nm值，根據公式分別計算酶標復合物中的酶結合量與抗原含量，計算其酶標記率。

酶結合量=OD403nm×0.42 (公式②)

抗原含量=(OD280nm-OD403nm×0.42) ×0.94×0.62 (公式③)酶標記率=P4-HRP中的酶量(mg) /加入的HRP酶量(mg)×100%(公式④)

2 結果

2.1 孕酮-半琥伯酸酯的鑒定

2.1.1 孕酮-半琥珀酸酯的 TLC 鑒定 由于11α-OH-P4和11α-OH-P4-HS分子結構的差異，二者極性也存在差異。本研究中，11α-OH-P4-HS在展開劑中的吸附性較強，而11α-OH-P4的吸附性較弱，因此，移動距離大的點為11α-OH-P4與副反應產物，移動距離小的點為11α-OH-P4-HS，鑒定結果如圖1所示，該反應已完全。

圖1 薄層色譜鑒定

2.1.2 孕酮-半琥珀酸酯的合成產率 根據公式①計算可得，11α-OH-P4-HS的產率為78.64%。

2.2 酶標抗原的鑒定

2.2.1 酶標抗原紫外掃描鑒定 紫外掃描鑒定見圖2，P4-HS、HRP以及產物三者的紫外掃描圖差異較大，產物紫外掃描于HRP、P4-HS均有不同。反應中小分子物質經透析已去除，因此推測產物為HRP偶聯物。

圖2 紫外掃描鑒定結果

2.2.2 免疫學鑒定 免疫學鑒定如圖3所示，產物隨稀釋倍數增大，其OD值減小，HRP和P4-HS的OD值基本不隨濃度變化而改變。結果表明，產物與P4單克隆抗體發生特異性反應，而HRP、P4-HS不會與之發生反應，即產物對P4單克隆抗體具有免疫學特性，HRP、P4-HS對P4單克隆抗體不具有免疫學特性。結合圖3結果，產物為HRP的偶聯物，HRP的偶聯物與P4單克隆抗體具有免疫學特性，則推測該偶聯物為P4-HRP。

圖3 免疫學鑒定結果

2.2.3 酶標記率 經過超微量紫外分光光度計檢測酶標復合物的 OD280nm 與 OD403nm 值，吸光度值分別為1.325、2.726，酶結合量1.145，其中抗原含量0.105，酶標記率22.9%。

3 討論

11α-OH-P4官能團為穩定的羥基，不能直接與HRP結合，需要先將羥基通過DMAP催化，變為較為活潑的酯基，即11α-OH-P4-HS，再用偶聯了琥珀酸酐的11α-OH-P4-HS進行試驗偶聯。羧基可以通過碳二亞胺與HRP中賴氨酸的氨基偶聯，形成酶標抗原。

碳二亞胺法合成完全抗原時，HRP中賴氨酸數量對酶標記率起決定作用。運用碳二亞胺法合成偶聯物，碳二亞胺(DCC、EDC)為中間物，活化11α-OH-P4-HS的羧基，在NHS的催化下，與HRP上的賴氨酸中氨基形成酰胺鍵偶聯，因此一個HRP上可以偶聯多個11α-OH-P4-HS，綜上，在碳化二亞胺反應中，11α-OH-P4-HS加入量應略微過量。

在反應中，過量的11α-OH-P4-HS以及碳二亞胺DCC、EDC和催化物NHS，均可能以不同的化學形態存在于終產物中，因此終產物中的很多副產物須進行純化去除。常用的純化方法有透析和凝膠層析兩種，由于透析法較凝膠層析法簡單、易操作、可行性強，因此本研究選擇透析純化法。為取得較高保留率，本試驗選用8 000-14 000分子密度的透析袋，截留分子量值約為保留的大分子值的一半，且實驗中小分子值遠小于最小保留量8 000；試驗中除偶聯物與載體蛋白外，其它都是小分子物質，因此終產物僅有蛋白以及蛋白偶聯物。

本試驗目的是制備用于ELISA試劑盒的P4-HRP，因此在鑒定制備是否成功時，首先選擇免疫學檢驗，通過倍比稀釋P4-HRP，使其與相應抗體反應，同時用11α-OH-P4和HRP做對照，檢測P4-HRP與P4抗體反應靈敏度。理論上11α-OH-P4與對應應一抗也存在特異性反應，但本試驗中不明顯或不存在，可能因為11α-OH-P4是小分子物質，在封閉過程中，其抗原表位可能被封閉液掩埋，因此特異性反應不明顯。通過11α-OH-P4、HRP以及P4-HRP三者不同的紫外掃描曲線與峰值，鑒定抗原制備成功與否是本試驗的關鍵。碳二亞胺法合成P4-HRP的過程緩慢而復雜，存在很多終產物，即使經過透析純化，也可能存在載體蛋白及載體蛋白復合物，這些復合物的紫外掃描曲線與反應物的也不同。因此紫外掃描法不能完全判定偶聯是否成功，還需結合免疫學檢驗進行鑒定。