提高PEG誘導雞血細胞融合率的方法研究

劉瑞芳,陳嘉軒,李艾欣,孫 喜,呂 立

(西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

所謂細胞融合就是指在外力(誘導劑或促融劑)的作用下，2個或2個以上的異源細胞或原生質體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象，又稱細胞雜交。體外誘導細胞融合的方法有物理法、化學法和生物法。化學法是利用化學試劑如聚乙二醇、二甲基亞砜、脂質體等改變細胞膜脂質分子排列誘導細胞融合。PEG誘導細胞融合受很多因素的影響,如細胞密度、PEG相對分子質量、PEG的體積分數(shù)等。該試驗以雞紅血細胞為材料,通過調整雞紅細胞保存液和pH,詣在提高細胞融合率，為PEG誘導細胞融合在本專科實驗教學中的應用提供參考依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 GKN溶液、1%Hanks溶液、50% PEG溶液、抗凝劑、阿氏液(Alsver)、0.85%生理鹽水、1%詹那斯綠B溶液。

1.1.2 試驗儀器 分析天平(日本島津有限公司)、低速離心機(湖南湘儀有限公司)、移液器(德國eppendorf有限公司)、恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)、光學顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)

2 試驗方法

2.1 血細胞懸液的制備

2.1.1 使用Alsver液制備血細胞懸液 雞翅下靜脈采血，將采集的血液注入含有檸檬酸鈉的Alsver液中，Alsver液與雞血按1︰3～1︰4的比例稀釋，制成雞血紅細胞儲備液。取儲備液1 mL，加入4 mL 0.85 %的生理鹽水，混勻，1 500 rpm離心5 min, 棄上清液，重復上述操作一次。所得沉淀用4 mL GKN溶液1 000 rpm離心3 min, 棄上清液，再用GKN溶液稀釋沉淀，制成血細胞懸液。

2.1.2 使用生理鹽水制備血細胞懸液 在肝素鈉抗凝采血管中用靜脈采血針采血 2～4 mL，輕輕顛倒采血管使血液充分與肝素接觸。取 0.5 mL抗凝全血與4.5 mL 0.85%的生理鹽水，混勻，1 500 rpm 離心 3 min，棄上清；再重復此步驟一次。所得沉淀用4.5 mL Hanks溶液1 000 rpm離心3 min, 棄上清液，再用Hanks溶液稀釋沉淀，制成血細胞懸液。

2.2 PEG誘導血細胞的融合

取1 mL上述細胞懸液于離心管中，加入0.5 mL預熱的50% PEG(Mr=4000)溶液， 39℃水浴中進行10 min的細胞融合。然后再加入GKN溶液終止細胞融合，每個水平5個重復。

2.3 血細胞染色及鏡檢

托底輕搖后，取1小滴懸液于載玻片上，加少量的詹那斯綠B染液，染色5 min左右，在顯微鏡下觀察細胞融合的情況并計數(shù)細胞融合率。

2.4 計算細胞融合率

隨機選取鏡下視野，在每個視野下讀取已融合和未融合的細胞數(shù)，計算細胞融合率。即：細胞融合率 = 已融合細胞核數(shù) / 總細胞核數(shù)×100 %。

2.5 數(shù)據(jù)分析

每個水平設 5 個重復，分別進行單因素方差分析和雙因素方差分析，以P<0.05 為差異顯著，P>0.05為差異極顯著。

3 結果與分析

3.1 不同血細胞保存方法對細胞融合率的影響

從表1中發(fā)現(xiàn)，利用肝素鈉抗凝采血管抗凝后的雞全血經(jīng)0.85%生理鹽水處理后，在4℃冰箱保存1周后，細胞膜完整，細胞核清晰，形態(tài)規(guī)則，穩(wěn)定性良好，細胞的融合率穩(wěn)定，隨著保存時間的延長，細胞的融合率沒有明顯變化。而使用Alsver液處理的血細胞，保存時間不超過24 h，隨著保存時間的延長，細胞的融合率明顯降低。

表1 不同血細胞保存方法對細胞融合率的影響

3.2 不同pH對細胞融合率的影響

從表2可看出， 隨著pH值的改變，細胞融合率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。pH為8時細胞融合率顯著高于pH為6.5、8.5和9.0(P<0.05)，與pH值為7.0和7.5時細胞融合率差異不顯著(P>0.05)，即pH值為6.5的酸性條件下，細胞的融合率最低，而pH為8時細胞的融合率最高。

4 討論

4.1 不同血細胞保存方法對細胞融合率的影響

Alsever液主要由檸檬酸鈉、檸檬酸、氯化鈉和葡萄糖組成，具有一定的抗凝血作用，也是一種等滲平衡的血細胞保存液。抗凝劑的一些成分與血液中的Ca2+形成難解離的可溶性絡合物，勢必導致血液中的Ca2+濃度降低。大量研究表明，血液中高Ca2+能夠促進和提高細胞融合率。本實驗使用Alsever液制備血細胞懸液組的細胞融合率顯著低于肝素鈉制備組，與前人的研究結果一致，可能是Alsever液的抗凝血作用直接導致Ca2+濃度降低，從而造成細胞融合率下降所致。生理鹽水處理組更有利于延長血細胞的保存時間，且不影響血細胞的融合率。

4.2 不同pH對細胞融合率的影響

從實驗結果發(fā)現(xiàn)，pH 是影響細胞融合率的關鍵因素之一，這與前人的研究結果一致。偏酸性條件下融合效率較低，當 pH=7～8時，細胞融合率有明顯升高的趨勢，說明弱堿性環(huán)境可促進細胞聚集接觸、引起磷脂雙分子層疏松重排，提高細胞的融合率。可能原因一可能是 pH對 PEG 活性產生了影響，原因二可能是 pH 對融合細胞自身產生了影響。當pH=8.5～9.0時細胞的融合率又出現(xiàn)下降趨勢，表明強堿性條件不利于細胞融合。

5 結論

在本科實驗教學時，選擇適宜觀察的有核紅細胞、便于操作的 50%濃度 的PEG為實驗材料；利用肝素類抗凝管采集血液，且 4℃保存細胞穩(wěn)定性好；全血與洗滌液和緩沖試劑按 1∶10 比例、pH為 8.0時進行融合的細胞融合率最高。