基于Nrf2/ARE通路研究銀杏葉滴劑對口腔潰瘍大鼠的作用機制*

鄭蕾，李國芳，楊盼盼，單志鳴

鄭州大學附屬兒童醫院，河南 鄭州 450000

近年來，隨著生活節奏的加快及飲食結構的改變，口腔潰瘍的發生率明顯升高。據臨床調查[1]，復發性口腔潰瘍發生率已達20%，對患者的生活和工作有諸多不便。口腔潰瘍屬于口腔黏膜的常見病，其病灶部位常伴隨充血水腫、灼痛感，嚴重者可影響飲食和語言交流，且根治困難[2-3]。目前，臨床治療口腔潰瘍多以對癥治療為主，包括補充維生素、抗感染等，但部分患者治療效果不理想，且易產生不良反應[4-5]。研究發現，口腔潰瘍的發病機制與局部氧化應激關系密切，氧化-抗氧化系統失衡則不利于潰瘍面愈合[6-7]。銀杏葉提取物是從銀杏葉中分離的成分，包括銀杏黃銅、銀杏多糖等多種活性成分，具有改善血液循環、降低血壓、抗氧化等多種生物學活性[8-10]。本研究通過建立口腔潰瘍大鼠模型，觀察銀杏葉滴劑(提取物)對其的治療效果，并初步探討其調控機制。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性SD大鼠，50只，8周齡，體質量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2017-0001，飼養于12 h/12 h明暗交替、溫度23～25 ℃、濕度45%～55%的條件下，倫理批號：20200101。

1.2 藥物及試劑銀杏葉滴劑(德國Dr.Willmar Schwabe藥廠，批號：C20201014)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為：A001-1-1、A006-2、A003-3-1)；兔抗鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、核因子E2相關因子(nuclear factor erythroid-2 related factor，Nrf2)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)單抗及山羊抗兔IgG抗體(美國SantaCruz公司，批號分別為：SC-25269、SC-28312、SC-17786、SC-51993)；逆轉錄試劑盒(Takara公司，批號：20190326)；BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo公司，批號：20190452)。

1.3 儀器7500型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；通用型電泳儀、CheniDoc XRS型化學發光成像分析系統(美國Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 模型建立及分組采用化學灼燒法[11]建立口腔潰瘍大鼠模型：50只大鼠中隨機選取40只用1%的戊巴比妥鈉(0.025 g·kg-1)以腹腔注射麻醉大鼠，手術鑷夾取直徑約1 mm的NaOH晶體在大鼠左側下唇靠口角黏膜處灼燒30 s，然后用無菌生理鹽水沖洗，形成潰瘍。將造模成功的大鼠按體質量隨機分為模型組、銀杏葉滴劑低劑量(25 mg·kg-1)組、銀杏葉滴劑中劑量(50 mg·kg-1)組、銀杏葉滴劑高劑量(100 mg·kg-1)組，另取10只大鼠僅作麻醉，不進行灼燒造模，作為對照組。連續給藥10 d，模型組和對照組大鼠灌胃等量生理鹽水。

2.2 潰瘍面積測定各組大鼠分別在給藥前(0 d)，給藥第1天、第3天、第7天，用游標卡尺測量潰瘍最大橫徑(D1)、最大縱徑(D2)，計算潰瘍面積[12]。

潰瘍面積=0.25×π×D1×D2(π=3.14)

2.3 檢測潰瘍組織中SOD、GSH-Px、MDA水平末次灌胃給藥1 h后，脫頸椎處死大鼠，立即取潰瘍組織，稱其質量，用預冷生理鹽水制備質量體積分數為10%的組織勻漿液，于4 ℃、2 800 r·min-1(離心半徑為10 cm)離心10 min，取上清液，分別采用黃嘌呤氧化酶法、羥胺比色法、硫代巴比妥酸比色法測定潰瘍組織中SOD、GSH-Px、MDA水平。

2.4 檢測潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1的蛋白表達每組隨機取3只大鼠口腔潰瘍組織，液氮研磨后轉至離心管，加入1×磷酸鹽緩沖液勻漿，提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，每個泳道進樣 20 μL，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，電轉1.5 h至硝酸纖維素膜，封閉2 h，加入一抗搖床孵育過夜(4 ℃)，洗膜后加入二抗，常溫孵育2 h，暗室中曝光、顯影。掃描拍照后，應用Image J軟件進行灰度值分析，以目的蛋白TH、Nrf2、HO-1與內參β-actin的灰度值比值表示其相對表達量。

2.5 檢測潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA表達每組隨機取3只大鼠的口腔潰瘍組織，Trizol法提取潰瘍組織中總mRNA，逆轉錄獲得互補鏈cDNA，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)，反應體系：SYBR Premix Ex Taq 13.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4.5 μL。反應條件：95 ℃ 預變性3 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，重復42個循環。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結果

3.1 大鼠的表觀指標40只大鼠全部建模成功，形成直徑約3 mm的潰瘍，表面附黃白色假膜，邊緣充血水腫；模型組大鼠出現毛發暗淡無光澤、活動頻繁、易激怒、弓背等表型，給予銀杏葉滴劑灌胃干預后，上述情況均得到緩解。

3.2 不同時間點大鼠潰瘍面積比較潰瘍面積組間、時間、交互比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；干預第0、1天潰瘍面積組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，干預第3、7天銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍面積均明顯減小(P<0.05)；與銀杏葉滴劑低劑量組比較，干預第3、7天銀杏葉滴劑中、高劑量組潰瘍面積均明顯減小(P<0.05)，且銀杏葉滴劑高劑量組小于中劑量組；與干預第0天比較，干預第1、3天模型組潰瘍面積均無明顯變化(P>0.05)，干預第7天其明顯減小(P<0.05)；與干預第0天比較，干預第1天銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍面積均無明顯變化(P>0.05)；干預第1、3、7天隨時間的延長潰瘍面積明顯減小(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 不同時間點大鼠的潰瘍面積比較

A：模型組；B：銀杏葉滴劑低劑量組；C：銀杏葉滴劑中劑量組；D：銀杏葉滴劑高劑量組

3.3 對大鼠潰瘍組織中SOD、GSH-Px、MDA水平的影響與對照組比較，模型組潰瘍組織中SOD、GSH-Px 水平均明顯降低、MDA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織中SOD、GSH-Px均明顯升高、MDA水平明顯降低(P<0.05)；與銀杏葉滴劑低劑量組比較，銀杏葉滴劑中、高劑量組潰瘍組織中SOD、GSH-Px均明顯升高、MDA水平明顯降低(P<0.05)，且銀杏葉滴劑高劑量組優于低劑量組。見表3。

表3 對大鼠潰瘍組織中SOD、GSH-Px、MDA水平的影響

3.4 對大鼠潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達的影響與對照組比較，模型組潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達均明顯升高(P<0.05)；與銀杏葉滴劑低劑量組比較，銀杏葉滴劑中、高劑量組潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達均明顯升高(P<0.05)，且高劑量的作用效果優于低劑量。見表4和圖2。

表4 對潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

圖2 Western Blot法測定大鼠潰瘍組織HT、Nrf2、HO-1蛋白表達

3.5 對大鼠潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA表達的影響與對照組比較，模型組潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA的相對表達均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA的相對表達均明顯升高(P<0.05)；與銀杏葉滴劑低劑量組比較，銀杏葉滴劑中、高劑量組潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA相對表達均明顯升高(P<0.05)，且高劑量作用效果顯著優于中劑量。見表5。

表5 對潰瘍組織中TH mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達的影響

4 討論

口腔潰瘍的致病機制目前仍不明確。研究認為，其發病與免疫異常、維生素缺乏、遺傳改變等多種因素有關[13-15]。西醫多通過應用糖皮質激素類藥物[16]、免疫調節劑改善癥狀，雖然短期內可緩解潰瘍的癥狀，但長期服用不良反應較大，且對復發性口腔潰瘍較難控制。中醫藥在治療口腔潰瘍中有一定優勢[17-18]。研究表明[19-20]，口腔潰瘍病灶部位的損傷不利于口腔黏膜自我修復。故尋找有效藥物改善病情有重要臨床意義。

本研究采用化學灼燒法建立口腔潰瘍大鼠模型，40只大鼠全部建模成功，提示該法模型復制成功率高，且穩定性、重復性好。本研究發現，模型組大鼠出現毛發暗淡無光澤、活動頻繁、易激怒、弓背等表現，給予銀杏葉滴劑干預后，上述情況均得到緩解，說明銀杏葉滴劑可緩解潰瘍引起的癥狀。與模型組比較，干預第3、7天后銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍面積均明顯縮小，且呈劑量依賴性；同時銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍面積隨干預時間的延長，潰瘍面積明顯縮小，提示銀杏葉滴劑可有效促進大鼠口腔潰瘍的愈合。銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織中SOD、GSH-Px水平均升高、MDA水平降低，且呈劑量依賴性，說明銀杏葉滴劑可有效改善口腔潰瘍大鼠氧化應激狀態。Bagan等[21]研究表明，活動性口瘡性口腔炎患者血清中MDA、GSH-Px 水平升高，與發生口腔潰瘍相關。銀杏葉滴劑在臨床上廣泛用于心腦血管疾病防治[22-23]，已有研究證實[24]，銀杏葉總黃酮可有效降低腦缺血損傷大鼠腦組織MDA水平、升高SOD、GSH-Px活性，抑制腦內氧化應激反應、減輕腦組織損傷。銀杏葉滴劑中含有銀杏葉總黃酮等活性物質，給藥后，口腔潰瘍大鼠潰瘍組織內氧化應激反應被有效抑制，從而促進潰瘍愈合。

本研究發現，模型組潰瘍組織中THmRNA、Nrf2、HO-1mRNA表達均低于對照組，提示大鼠口腔黏膜的發病機制與氧化應激損傷有關；銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA的表達均較模型組升高，且呈劑量依賴性，提示銀杏葉滴劑可能通過激活潰瘍組織內Nrf2/ARE通路促進口腔潰瘍恢復。Nrf2是Cap′n′collar調節蛋白家族重要成員，在炎癥、糖尿病、腫瘤等多種疾病的病理生理過程中發揮關鍵作用[25-28]。Nrf2是細胞抗氧化應激關鍵因子，當機體接收外界刺激信號后，其進入細胞核中，與下游ARE結合從而調控多種抗氧化因子表達，抑制氧化反應[29-31]。Nrf2/ARE通路激活后，其下游內源性保護因子 HO-1 表達增加，從而抑制潰瘍病灶的氧化應激反應，減輕口腔黏膜氧化應激損傷[32]。

綜上所述，銀杏葉滴劑可有效促進大鼠口腔潰瘍愈合，可能與激活潰瘍組織內Nrf2/ARE通路，改善氧化應激狀態有關，這為臨床上銀杏葉相關藥物的開發及用于治療口腔潰瘍提供參考。