炒酸棗仁對狀態性焦慮大鼠基底外側杏仁核神經元信息編碼的影響研究

華伊，張正一，黃莉莉，王艷艷，葉曉楠，李廷利

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗(ZiziphusjujubaMill.var.spinosae(Bunge)Hu ex H.F.Chou)的干燥成熟種子，主治虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗等癥[1]。現代研究發現酸棗仁具有一定的抗狀態性焦慮作用[2-3]，酸棗仁在臨床的應用普遍使用炒制品。狀態性焦慮指機體面對某一特定情境而產生的暫時的緊張不安的情緒狀態，曠場實驗是一種被廣泛應用的狀態性焦慮動物模型建立及行為學評價方法[4-5]。在腦科學領域，杏仁核(Amygdala)被普遍認為是情緒調節尤其是焦慮、恐懼等負性情緒調節過程中的最關鍵腦區[6-7]，杏仁核的基底外側核團(Basolateral amygdala，BLA)是進行焦慮處理時接收外界刺激傳入的主要部位[8]。目前為止，炒酸棗仁的抗狀態性焦慮作用在神經元在體電活動方面的機制尚未清晰。基于以上，本文利用曠場實驗方法和在體多通道神經同步記錄技術，擬考察炒酸棗仁水煎液對狀態性焦慮大鼠的曠場行為學及BLA區神經元信息編碼的影響，探討炒酸棗仁對狀態性焦慮的干預作用及神經電生理方面的作用機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體質量(220±20)g，無特定病原體(SPF)級，購于黑龍江中醫藥大學GLP實驗動物中心，許可證號：SCXK(黑)2013-004。

動物飼養與監測環境維持為通風、避光、隔音、電磁屏蔽狀態，并通過光控定時開關程序進行12 h/12 h明暗交替光照處理，室內溫度：20～24 ℃，相對濕度：50%～60%，噪聲≤40 dB。

1.2 實驗藥物

酸棗仁，原產地山西，依照文獻[9]方法，制備炒酸棗仁和炒酸棗仁水煎液。

1.3 實驗試劑

生理鹽水(170104D5，哈爾濱三聯藥業有限公司)，戊巴比妥鈉(WS20140104，國藥集團化學試劑有限公司)，義齒基托聚合物(170308，上海Pigeon Dental有限公司)，義齒基托樹脂(20170408，上海New Century Dental Materials有限公司)，多聚甲醛(20161130，天津基準化學試劑有限公司)，無水乙醇(20160408，天津市天力化學試劑有限公司)等。

1.4 實驗儀器

半微量分析天平(MS105/A，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，曠場實驗箱(100 cm×100 cm×40 cm，木制)，標準腦立體定位儀(51600，美國Stoelting公司)，在體多通道神經記錄分析系統(OPX-32D，美國Plexon公司)，低溫冷凍組織切片機(CM1950，德國Leica公司)，強制對流標準型烘箱(Venticell 111，德國 MMM 集團公司)等。

2 實驗方法

2.1 在體多通道記錄電極的埋植

選取大鼠20只，經戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，借助腦立體定位儀，圖譜[10]，確定BLA區位置(坐標：前囟后2.5～2.8 mm，中縫線右4.5～4.8 mm，顱骨下7.5 mm)。將16(4×4陣列)通道在體記錄微電極(鉑銥合金，電極絲外周涂有絕緣層，直徑35 μm)埋置于大鼠的BLA區域，用義齒基托樹脂將整個電極部分固定在大鼠顱頂。手術后每只大鼠單獨飼養恢復5 d。

2.2 動物的分組及給藥

將已植入電極并經過術后恢復的大鼠隨機分為模型對照組與炒酸棗仁組，每組各10只。經灌胃途徑給予炒酸棗仁組大鼠炒酸棗仁水煎液(17.5 g/kg)，模型對照組灌服相同體積的蒸餾水。

2.3 模型的制備及行為學測試

依照文獻[11]方法，利用曠場實驗制備大鼠狀態性焦慮模型。給藥0.5 h后，將各組大鼠放入曠場箱內底面中心，任其自由探索，記錄并分析10 min內大鼠在曠場環境中的行為學表現。測試指標為跨格次數、站立次數、進入中央格次數、中央格運動時間(s)和總運動時間(s)，并以中央格運動時間(s)除以總運動時間(s)計算中央格/總運動時間(%)。

2.4 神經元放電信號的采集

給藥0.5 h后，利用在體多通道神經記錄分析系統，先記錄各組動物在日常飼養環境中10 min內的神經元基礎放電信號，再在進行曠場實驗的同時記錄曠場環境中10 min內的神經元曠場放電信號。利用Offline Sorter軟件對采集到的神經元放電信號進行處理，過濾低頻放電和環境干擾放電，設置信噪比大于3的信號為所需的動作電位(Spikes)信號，運用主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)技術對分離出的動作電位進行聚類處理，測試指標為神經元動作電位的放電頻率(spikes/s)。

2.5 組織學考察

電信號采集全部結束后，各組動物顱頂在體記錄電極經電刺激器進行通電刺激(1 mA，10 s，5次左右)，摧毀電極末端腦組織。灌流取腦，利用腦組織冰凍切片的HE染色技術判定記錄電極是否準確植入大鼠的BLA區域，偏離位置的數據不予采用。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 炒酸棗仁對狀態性焦慮大鼠行為學的影響

實驗結果表明，與模型對照組相比，炒酸棗仁組大鼠在曠場中的跨格次數、站立次數及總運動時間無明顯變化(P>0.05)，中央格運動時間、進入中央格次數及中央格/總運動時間(%)明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠曠場行為學比較

3.2 炒酸棗仁對狀態性焦慮大鼠BLA區神經元信息編碼的影響

3.2.1 組織學考察

大鼠腦組織冰凍切片的HE染色結果顯示，在體多通道記錄電極準確植入大鼠BLA區。切片見圖1。

注：圖A為大鼠腦立體定位圖譜所示BLA區位置；圖B為大鼠腦組織切片HE染色圖，空腔指示為記錄電極末端所處位置。圖1 記錄電極定位HE染色結果(50×)

3.2.2 大鼠BLA區神經元動作電位分類

本實驗在大鼠BLA區記錄到的神經元動作電位波形特征為：波長較長，波峰后曲線下降緩慢。按照放電模式的不同，把在BLA區記錄到的神經元分為Ⅰ、Ⅱ兩類(以下稱BLA區Ⅰ類神經元為NeuronⅠ，Ⅱ類神經元為NeuronⅡ)。NeuronⅠ的時長較長、振幅稍低，自相關圖中出現典型的尖峰、峰值后呈現非常陡的下降趨勢。NeuronⅡ的時長較短、振幅較高，自相關圖中峰值后下降較緩慢。兩類神經元動作電位放電模式的特征圖見圖2。

注：圖A為NeuronⅠ動作電位的波形圖、放電間隔直方圖及自相關圖，圖B為NeuronⅡ動作電位的波形圖、放電間隔直方圖及自相關圖。圖2 BLA區兩類神經元動作電位特征圖

3.2.3 炒酸棗仁對狀態性焦慮大鼠BLA區神經元動作電位放電頻率的影響

實驗結果表明，與自身的基礎放電頻率相比，模型對照組和炒酸棗仁組大鼠在曠場中的NeuronⅠ、NeuronⅡ動作電位放電頻率均有所增加，放電頻率直方圖見圖3。將每只大鼠的曠場放電頻率減去其基礎放電頻率，得出的值定義為神經元動作電位放電頻率增加值，以此值進行兩組大鼠在曠場中神經元動作電位放電頻率變化的對比。實驗結果表明，與模型對照組相比，炒酸棗仁組大鼠BLA區NeuronⅠ的動作電位放電頻率增加值明顯減少(P<0.05)，NeuronⅡ的動作電位放電頻率增加值無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠BLA區神經元動作電位放電頻率增加值比較

3.3 大鼠曠場行為學與BLA區神經元信息編碼的相關性分析

實驗結果表明，大鼠在曠場中的中央格/總運動時間(%)與BLA區NeuronⅠ的動作電位放電頻率增加值之間存在明顯的負相關(r=-0.614，P<0.01)，與NeuronⅡ的動作電位放電頻率增加值之間存在明顯的負相關(r=-0.504，P<0.05)。見圖4。

圖4 曠場中央格/總運動時間(%)與BLA區神經元動作電位放電頻率增加值的相關性分析

4 討論

曠場實驗利用了嚙齒動物害怕空曠環境的天性，但又對陌生場地產生好奇而試圖探索的矛盾心理[12]，被廣泛應用于狀態性焦慮動物模型的復制與評價[13-14]。本文利用曠場實驗建立大鼠狀態性焦慮模型，運用行為學實驗方法和在體多通道神經同步記錄技術，給予炒酸棗仁水煎液的干預，記錄并分析了炒酸棗仁對狀態性焦慮大鼠的曠場行為學及BLA區神經元信息編碼的影響。

對嚙齒動物而言，曠場的中央格區域具有潛在威脅，周邊格相對安全，大鼠的焦慮程度高時會更偏向于在周邊格活動[15-16]。曠場中的跨格次數、站立次數和總運動時間等行為學指標可用于評價大鼠的活動性和探索行為，進入中央格次數、中央格運動時間及中央格/總運動時間則指示了大鼠的焦慮水平。在行為學實驗中，給予炒酸棗仁水煎液干預后，大鼠的跨格次數、站立次數及總運動時間有所增多，運動性與探索行為增加，這與報道[17]相符。同時，炒酸棗仁能明顯增加大鼠的中央格運動時間、進入中央格次數及中央格/總運動時間(%)，大鼠的焦慮樣行為減少，與前人研究[18]結果一致，提示炒酸棗仁能減輕曠場對大鼠造成的焦慮情緒。

注：0～10 min為大鼠在日常飼養環境中的基礎放電，10～20 min為在曠場環境中的放電。圖3 曠場對大鼠BLA區神經元動作電位放電頻率的影響

大腦對信息的處理是通過神經元群的協同工作實現的，動作電位則是神經元進行信息傳遞的基本語言[19]。神經元動作電位的發放具有“全或無”的特點，外界刺激信息發生改變時，動作電位的放電頻率也會發生相應的改變。神經元信息編碼的研究本質上就是對神經元動作電位的放電頻率進行的研究，這對于探索大腦進行各種智能行為的神經機制、揭秘大腦對外部事件的編碼機制具有重要意義[20]。杏仁核神經元網絡的同步活動在大腦情緒功能中發揮重要的作用[4-5]。大腦進行焦慮調節的過程中，感覺信息從丘腦和感覺皮質傳遞到基底外側杏仁核(BLA)，然后投射到中央杏仁核，再傳遞到下丘腦和腦干結構，產生自主神經等反應[21]。焦慮發生的同時伴有杏仁核功能的改變[21-22]，焦慮反應的增加與BLA區的異常活動有關[23]。

我們運用在體多通道神經同步記錄技術，通過鉑銥合金陣列記錄微電極，監測大鼠的在體BLA區神經元同步電信號。本文記錄到的BLA區神經元動作電位的波形特征為波長較長，波峰后曲線下降緩慢，與文獻[24]報道一致。按照發放特征的不同，將記錄到的BLA區神經元分為NeuronⅠ與NeuronⅡ。本研究發現，與自身的基礎放電相比，各組大鼠在曠場中NeuronⅠ、NeuronⅡ的動作電位放電頻率都有所增加。這一現象反映了大鼠面對曠場環境時，其BLA區神經元信息編碼發生了改變，與前人報道[25]一致。我們將各只實驗動物的曠場放電頻率減去其基礎放電頻率，得出的值定義為神經元動作電位放電頻率增加值，以此值進行兩組大鼠神經元動作電位放電頻率變化的對比。結果顯示，炒酸棗仁明顯降低了大鼠BLA區NeuronⅠ的動作電位放電頻率增加值，提示炒酸棗仁通過降低BLA區NeuronⅠ的動作電位放電頻率，抑制曠場對大鼠造成的焦慮狀態。

由于曠場的中央格區域對動物而言存在潛在危險，動物的焦慮程度越高，越不喜愛在中央格運動，實驗動物在曠場中的中央格/總運動時間(%)這一指標與動物的焦慮程度呈負相關[14]。相關性分析結果顯示，大鼠在曠場中的中央格/總運動時間(%)與BLA區NeuronⅠ、NeuronⅡ的動作電位放電頻率增加值間均存在明顯的負相關，證明BLA區神經元的活動情況確與動物的焦慮狀態密切相關，且本實驗采集到的兩類BLA區神經元的活動性均隨焦慮程度的增加而增加。由于曠場興奮了大鼠的Ⅰ、Ⅱ兩類BLA區神經元，進一步證實了曠場中的大鼠處于焦慮狀態。同時我們發現，BLA區NeuronⅠ和NeuronⅡ均為焦慮相關神經元，但是炒酸棗仁只降低了NeuronⅠ的動作電位放電頻率，而NeuronⅡ的放電情況無明顯變化。推測炒酸棗仁并不是對BLA區所有類型的神經元均有干預作用，炒酸棗仁對焦慮的拮抗作用也并不是只通過某一個腦區，而是多個腦區共同作用的結果，具體原因還需進一步研究。

綜上所述，炒酸棗仁具有拮抗狀態性焦慮的作用，其神經電生理作用機制與降低BLA區神經元動作電位放電頻率、改變BLA區神經元信息編碼有關。本研究結果在神經電生理層面闡述炒酸棗仁的抗狀態性焦慮作用，進一步明確焦慮樣行為與BLA區神經元在體活動的關系，為焦慮相關的新藥研發和臨床應用奠定理論基礎。