丹參活性成分對心肌缺血再灌注損傷保護作用及機制研究進展

李永鑫，高彥宇，胡曉陽，沈芳玲，李文慧，李冀

(黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

丹參為唇形科植物丹參的干燥根及根莖。其味苦，微寒，歸心、肝經，具有活血祛瘀、涼血消癰、清心除煩等功效，為現代臨床治療心血管疾病常用中草藥。目前已經初步從丹參中分離鑒定100余種成分主要包括脂溶性菲醌類以及水溶性多聚酚酸類成分。脂溶性二萜醌類化合物主要包括:丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱參酮等其中參酮ⅡA含量相對較高，丹參脂溶性成分目前均以丹參酮為有效成分的參考指標。水溶性酚酸類化合物:主要成分有丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸及丹酚酸A,B,C等。現代藥理學及臨床研究表明丹參具有抗動脈粥樣硬化、抗心律失常、降血脂、降血壓及改善血液循環等多種心血管疾病防治作用[1-3]。丹參活性成分的研究成為近年來研究的熱點和重點。本文查閱近年來國內外相關文獻，現對丹參活性成分對心肌缺血再灌注損傷保護作用的體內外研究進行綜述，為中醫藥新產品開發以及臨床辨證治療用藥提供理論指導。

1 丹參活性成分多角度抗心肌缺血再灌注損傷

1.1 清除氧自由基、抗氧化

心肌血氧供應不足時，心肌細胞有氧代謝功能異常導致代謝廢物活性氧自由基增多，過多的活性氧自由基難以及時被心肌清除，會與細胞膜上的不飽和脂肪酸反應而損傷細胞結構，從而使心肌缺血的現象更加嚴重。研究表明[4]丹參素對I/R損傷時離體心臟的氧化應激具有保護作用，能夠清除活性氧(ROS)和提高內源性抗氧化劑SOD、CAT、GSH-Px和HO-1活性，并且該機制與激活Akt/ERK1/2/Nrf2信號通路增強抗氧化防御系統有關。王木蘭等[5]研究發現，丹酚酸A能明顯抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷所致血漿中LDH、AST、CK以及CK-MB活性的升高，并能明顯提高血漿NO含量，降低血漿MDA含量，從而抑制心肌脂質過氧化，起到保護血管內皮和保護心肌的作用。在缺血心肌中，氧化應激導致活性氧(ROS)的過度生成和積累，是心肌缺血損傷的中心環節。研究發現[6]，丹酚酸B對心肌缺血損傷大鼠有良好的心肌保護作用，主要是清除氧化應激引起的ROS生成和積累，減輕心肌缺血損傷和心肌細胞死亡。

1.2 抑制心肌細胞鈣超載

Ca2+對維持心肌能量代謝極為重要，在正常生理狀況下，心肌細胞外Ca2+濃度遠高于細胞內。當心肌血氧供應不足時，會使細胞內Ca2+濃度異常增加，而出現Ca2+超載的現象。對于心肌細胞內Ca2+超載主要與Na+/Ca2+交換有關，還可能與心肌細胞膜對Ca2+的通透性增大以及肌漿網對Ca2+的攝取能力降低有關[7]。當Ca2+超載時會對線粒體造成一系列影響，從而導致細胞損傷引起細胞凋亡。哺乳動物TRP通道的發現是研究Ca2+進入分子基礎的一個新的起點，這一發現極大地促進了心血管疾病研究的發展，TRP家族對鈣具有高度的滲透性[8]。有研究表明[9]丹參素預處理組可以降低I/R損傷誘導的H9c2細胞中TRPC6蛋白表達、Ca2+水平以及細胞凋亡率。蘇亞平等[10]通過制備急性心肌梗死模型，發現丹參酮ⅡA注射液可以下調造模后心肌細胞CaMKⅡm RNA、CaM表達,抑制Ca2+與CaM-CaMKⅡ信號轉導途徑,阻斷了Ca2+過多內流使心肌正常除極而避免由鈣超載誘導心肌梗死并通過擴張冠狀動脈而達到心肌缺血的保護作用。

1.3 改善能量代謝

當心肌血氧供應不足時，有氧代謝受到抑制，ATP生成減少，心肌能量代謝以無氧方式為主，產生大量乳酸導致心肌細胞內酸中毒。同時心肌細胞內Ca2+內流增多，線粒體從胞漿攝取過量的Ca2 +，造成線粒體Ca2 +超載引起膜通透性改變，心肌能量代謝障礙導致細胞超微結構異常，造成不可逆損傷[11]。膜電位下降是線粒體生成ATP減少的重要原因之一，其穩定與否與線粒體通透性轉換孔(mPTP)有關，而ROS又是mPTP開放的重要誘因之一。孫大偉等[12]通過制備離體心臟灌流系統構建模型，發現10 μmol/L的丹參素可以下調FoxO1 mRNA表達，減少ROS生成，抑制mPTP過度釋放以及穩定膜電位從而改善缺血再灌注損傷。有研究表明[13]MI/RI發生后細胞中Ca2+-Mg2+-ATP 酶和Na+-K+-ATP 酶活性均有明顯降低，表明再灌注后心肌組織能量代謝障礙，而丹酚酸B不同濃度預處理組均可提高心肌細胞中ATP酶活性，減少心肌梗死面積。馬春香等[14]研究發現丹參酮ⅡA可以通過抑制mPTP過度開放以及減少細胞色素C的釋放來減輕心肌細胞凋亡從而實現心肌保護。

1.4 抑制心肌細胞凋亡

細胞凋亡是一種程序化的由基因控制的細胞自然死亡的形式。但是當心肌缺血時，會逐漸出現大量損傷心肌細胞凋亡的現象，細胞凋亡參與心肌MIRI損傷的過程，多種原因如氧自由基增多、Ca2+超載、能量代謝障礙等都是加劇細胞凋亡的誘因。凋亡機制起始于數個蛋白從線粒體釋放，包括細胞色素C一旦釋放到細胞質中便與蛋白質Apaf1相互作用形成復合物并激活蛋白酶Caspase-9；Caspase-9激活另外的Caspase家族的成員導致不可逆轉的蛋白酶活性升高，則細胞進入凋亡模式。Caspases蛋白酶的級聯激活是凋亡過程的中心環節，Bcl-2家族蛋白是主要控制因素[15]。有研究表明[16]MIRI損傷大鼠通過丹參多酚酸鹽治療能減少心肌梗死面積，減少心肌細胞凋亡，明顯上調凋亡相關蛋白Bcl-2、抑制Bax和激活型Caspase-3表達。JAK/STAT 信號通路的激活可以抑制細胞凋亡，保護心肌細胞，而 JAK2/STAT3是JAK/STAT通路中的重要成員之一。AG490是JAK2的特異性抑制劑，可以阻斷JAK2下游蛋白STAT3的磷酸化。張美齊等[17]研究發現丹參酮ⅡA組相對于模型組細胞凋亡數量明顯減少，WB結果顯示丹參酮ⅡA可以誘導JAK2、STAT3表達增加，而加入AG490后明顯消弱這一作用，表明丹參酮ⅡA保護心肌、減少細胞凋亡的作用可能通過激活AK2通路，誘導STAT3的磷酸化實現的。

1.5 調節自噬

細胞自噬是將細胞內受損、變性或衰老的蛋白質以及細胞器運輸到溶酶體內進行消化降解的過程，在心臟中心肌細胞自噬對維持心肌功能具有重要的作用，心肌缺血時，自噬可以通過多種途徑來保護心肌細胞免受心肌缺血引起的損傷，自噬信號通路在心肌MI/RI過程中起重要調控作用。目前研究較多的是線粒體自噬，通過線粒體自噬可以消除細胞內受損的線粒體，促進線粒體在體內的更新以及維持線粒體在細胞內的數量，從而保護和維持心肌細胞功能[18-19]。在心血管系統疾病中，miR-30a通過Beclin-1蛋白在血管緊張素II引起的心肌損傷中調節自噬起重要作用，miRNA-30a可以直接與Beclin-1的3′-UTR結合并促進其mRNA的降解[20]。LI D等[21]研究發現丹酚酸B可以抑制小鼠原代心肌細胞I/R損傷，提高細胞活力，降低LDH漏出。丹酚酸B能顯著降低beclin-1、LC-Ⅱ的表達，在將miR-30a抑制劑轉入心肌細胞后，發現miR-30a抑制劑可以減弱丹酚酸B誘導的心肌保護作用，對抗模擬I-R損傷誘導的自噬，表明Sal B通過miR-30a上調介導的自噬抑制保護心肌細胞。適度的自噬可以清除再灌注過程中的ROS，而過度自噬則損傷心肌細胞。孫大偉等[22]研究發現丹參素預處理可抑制H/R損傷H9c2心肌細胞自噬基因LC3、Beclin-1表達。抑制細胞過度自噬充分發揮清除ROS的作用，減少其對ATP5G1的過氧化損傷，而起到保護心肌細胞的作用。mTOR作為一種典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在缺血損傷的自噬和凋亡中起著重要的調節作用，對心臟的結構和功能起著重要的作用[23]。研究表明[24]丹參素的預處理顯著提高了細胞存活率，并防止了I/R引起的心功能惡化，降低I/R期間凋亡蛋白和自噬相關蛋白Beclin-1、LC3及p62的上調，而加入雷米帕素(mTOR抑制劑)后抑制了這種作用，表明丹參素對自噬具有負性調節作用且激活mTOR是丹參素調節細胞凋亡和自噬的重要機制。

1.6 抑制炎性反應

炎性反應參與心肌損傷的全過程。當心肌缺血/再灌注時，中性粒細胞增多阻塞毛微血管，還可黏附并遷移至內皮下與內皮細胞上的黏附因子結合釋放如TNF-α、IL-1、IL-6等炎性介質，從而擴大炎癥反應，因而抑制炎性因子表達有助于抵抗心肌缺血再灌注的作用。HMGB1是一類高度保守的非核蛋白，存在于大多數真核細胞中。當HMGB1受到某些因素的刺激時，可通過主動分泌或被動釋放進入細胞間隙，介導炎癥反應[25]。有研究表明[26]大鼠腹腔注射15 d丹參酮ⅡA后建立再灌注模型，發現與IR組相比，不同劑量給藥組均可提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA、TNF-α、IL-6、iNOS水平，不同劑量丹參酮ⅡA處理大鼠心肌組織中HMGB1的含量均可明顯減少，表明丹參酮ⅡA可通過抑制ROS升高及HMGB1表達來減輕心肌組織炎癥反應。權偉等[27]采用結扎冠狀動脈復制大鼠MI/RI損傷模型，發現丹參素鈉高劑量組(60 mg·kg-1)TNF-α、IL-1 、IL-6均顯著小于模型組，且所有給藥組心肌組織的病理損傷也小于模型組，表明丹參素鈉對大鼠MI/RI損傷有保護作用，其機制與抑制炎癥反應有關。WEI G等[28]發現原兒茶醛預處理能明顯降低I/R模型TNF-α、IL-6和NO水平，減少心肌梗死面積。一些研究表明PPARγ通過負性調節巨噬細胞分化和活化過程中誘導的促炎癥基因表達而發揮抗炎作用。 JICHUN H等[29]研究發現迷迭香酸對I/R損傷有明顯的心臟保護作用。迷迭香酸預處理可以恢復大鼠心臟I/R損傷模型中降低的心臟血流動力學參數，減少梗死面積和心肌細胞凋亡，抑制I/R誘導心肌損傷大鼠心肌組織炎性細胞因子(IL-6、TNF-α和CRP)、PPARγ表達上調和NF-κB表達下調。表明迷迭香酸介導的心臟保護機制之一是通過其抗炎特性。心肌組織中MPO主要由NEU分泌，其水平與NEU激活程度顯著相關，ICAM-1 抗體可抑制心肌組織內NEU與血管內皮細胞之間的黏附，改善心肌損傷。夏楊等[30]研究表明丹酚酸B預處理可以降低心肌MPO活力、ICM-1陽性表達以及炎癥因子TNF-α、IL- 1β 的生成。

1.7 抗血小板聚集

血小板在生理或病理條件下發生黏附聚集，會使冠脈血流不暢，心肌血氧供應不足而誘發心肌缺血。血小板在I/R損傷中起關鍵作用。再灌注后，血小板與內皮下膠原接觸可刺激血小板黏附和活化。YUAN X等[31]于再灌注開始前10 min，大鼠頸靜脈注射丹酚酸A(10 mg/kg)，再灌注3 h后，用血小板聚集儀測定血小板聚集，發現丹酚酸A有較強的血小板活性，能夠降低二磷酸腺苷誘導的血小板聚集。且在再灌注后3、24 h降低了血清P-選擇素水平，P-選擇素存在于活化血小板上，一旦血小板在缺血和再灌注期間被激活，P-選擇素可能會從膜上被裂解，形成可溶性形式，可以在血漿中檢查到。因此丹酚酸A可能通過抑制血小板活化和改善冠狀動脈血流來降低冠狀動脈血栓。

1.8 調節血管內皮功能及促進微血管再生

內皮細胞可以分泌多種調控血管收縮和舒張的活性因子，來抑制血小板的黏附聚集。血管內皮細胞功能障礙會使動脈血管調節功能失調從而導致冠狀動脈粥樣硬化的發生。NO是一種擴血管因子，可促進內皮細胞增殖，增加冠脈血流量，ET-1是一種強力的血管收縮肽，能夠產生血管收縮作用[32]。NO/ET-1兩者共同維持體內血管內環境的平衡。當心肌缺血時，促進ET-1分泌而打破平衡，使血管壁收縮從而加劇心肌缺血。周淑妮等[33]通過對192例冠心病心絞痛患者作為研究對象，在常規冠心病治療基礎上采用注射用丹酚酸鹽治療14 d，發現給與丹酚酸鹽治療后，心絞痛發作次數、硝酸甘油使用劑量均較治療前明顯降低，血清中ET-1水平明顯降低，NO水平明顯升高。

血管內皮生長因子(VEGF)在促進血管生成中發揮重要作用，特別是在損傷和缺血組織的血管修復中[34]。周丹等[35]通過結扎冠脈制備大鼠MI/RI模型，發現丹酚酸B預處理可以減輕心肌梗死面積，增加心肌梗死邊緣區域微血管密度，不同濃度丹酚酸B預處理組均可增加心肌梗死邊緣區域Nrf2 、HO-1以及VEGF的表達，表明丹酚酸B有促進缺血心肌區域血管再生的功能。劉家軍等[36]在制備家兔心肌H/R損傷模型前經丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液預處理，可明顯提高 VEGF及mRNA表達，提高氧自由基清除酶的活性，加快缺血心肌血管內皮新生，促進血管新生。

表1 丹參主要有效成分對心肌缺血再灌注損傷的保護作用(近5年)

續表1

2 結語

心肌缺血是指心肌血氧供應不足引起心肌代謝及結構改變，主要由于冠脈粥樣硬化斑塊縮小血管內徑導致血流量減少引起。血壓降低、冠脈阻塞、心肌病變等都會導致心肌缺血進而出現多種心臟疾病，嚴重者出現心源性休克從而威脅生命[40]。丹參活性成分丹參素、丹酚酸A,B、原兒茶醛、迷迭香酸、丹參酮ⅡA等均可在機體、組織、細胞水平上發揮防治心肌缺血再灌注損傷的作用。近年來關于丹參有效成分防治心肌缺血再灌注損傷相關機制也不斷被揭示，主要與氧自由基、鈣超載、能量代謝、細胞凋亡、自噬、炎癥反應、血小板聚集、內皮細胞及微血管再生等因素有關，他們如同一個網絡互相交織共同保護心肌。如心肌細胞胞漿內Ca2+濃度過高會造成心肌能量代謝障礙的現象。內皮細胞功能障礙會導致血小板聚集黏附從而阻礙冠脈循環等。相信隨著丹參有效成分的深入研究可以為丹參復方配伍、組分配伍等研究及新產品開發提供理論依據。