針灸“肺俞”“大椎”“風門”對哮喘模型大鼠肺組織STAT6、血清IL-13表達的影響

徐寧，邵素菊，華金雙，王培育，張君，任重，胡曉京，田麗

(1.河南省中醫院，河南 鄭州 450002; 2.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450008)

支氣管哮喘是臨床常見的慢性呼吸道疾病之一，是由多種細胞和細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。臨床癥狀常表現為反復發作性的氣急、喘息、胸悶或咳嗽等，在夜間或清晨最為多發[2]。哮喘的發生與氣道壁Th2細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的激活密切相關。白介素-13(IL-13)是引起哮喘患者氣道炎癥發生和發展的重要炎癥因子[3]，其誘導過敏反應是通過嗜酸粒細胞、IgE介導的反應[4]。STAT6作為信號轉導和轉錄激活因子，參與細胞增殖、分化、遷移等多個過程，是哮喘發生發展過程中的重要轉錄激活因子[5]。本實驗所選腧穴肺俞、大椎、風門是國家名老中醫邵經明教授經過幾十年的臨床及實驗研究總結出來的治療哮喘的經驗有效穴，該穴組經過大量實驗研究，已證實其可以緩解氣道炎癥，降低氣道高反應性，改善氣道重塑，其治療哮喘是通過多途徑、多靶點實現的[6-7]。IL-13及STAT6 mRNA參與了多種氣道炎癥，在哮喘中發揮著重要作用，本實驗通過觀察針灸對哮喘模型大鼠血清中IL-13及肺組織STAT6 mRNA表達的影響，探討“邵氏五針法”改善哮喘癥狀及治療哮喘的作用機制，為針灸治療哮喘提供更為科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取成年雄性SPF級SD大鼠40只，體質量160～180 g。購買后在通風良好、適宜的溫度和濕度環境中分籠適應性飼養5 d后，根據計算機隨機數字表隨機分為空白組10只、模型組10只、針刺組10只和艾灸組10只。

1.2 主要試劑與儀器

卵蛋白(美國Sigma公司)；31號一次性毫針(0.30 mm×13 mm,中研太和)；細艾條(0.7 cm×10 cm南陽漢醫艾絨有限責任公司)；IL-13 ELISA檢測試劑盒(CK-E30477R)；切片機(德國徠卡公司)；彩色圖像分析系統(西安華海電子有限公司)；光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號：CX21)；霧化器(遼寧省鞍山無線電一廠)；RT-PCR試劑盒(TransgelCHINA)；β-actin引物(賽百盛)；熒光定量PCR儀(ABI7500 Applied Biosystems)。

1.3 模型制備

參照《肺臟免疫學及免疫相關性疾病》[8]造模方法，建立大鼠哮喘模型。

在實驗的第1天和第8天分別對各組大鼠以10%的卵蛋白溶液進行腹腔注射1 mL，空白組用0.9%生理鹽水代替，進行致敏。在實驗第15天取1%的卵蛋白溶液由超聲霧化器霧化20 min，進行激發，每日1次，連續激發7 d。以大鼠出現呼吸急促喘息，節律加快或不齊，反應遲鈍，毛色失去光澤，大便不調為造模成功。

1.4 治療方法

針刺組：從實驗第15天起，選用一次性毫針(0.30 mm×13 mm)，“肺俞”(雙)直刺6 mm，“大椎”直刺5 mm，“風門”(雙)直刺6 mm，三穴均采用平補平瀉法，每次留針20 min，留針期間每10 min行針1次，起針后激發，每天1次，共針刺7次。穴位定位參照《實驗針灸學》。

艾灸組:從實驗第15天起，將艾條點燃后，在距離“肺俞”(雙)皮膚上方2～3 cm施行溫和灸、在距離“大椎”“風門”(雙)皮膚上方2～3 cm施行回旋灸，每次灸10 min，每天灸1次，灸畢進行激發，共灸7次。

空白組和模型組：不做任何治療，只給予如針刺、艾灸組相同抓握刺激。

1.5 標本取材

末次激發24 h內大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)，待大鼠麻醉后，打開腹腔，取腹主動脈血5 mL，以3 000 r/min，離心30 min,取上層血清，-20 ℃冰箱保存,ELISA待測。

打開胸腔暴露肺及心臟，即刻取右肺中下葉(包括肺門)，用4 ℃生理鹽水將其漂洗干凈后，立即放入新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，用石蠟包埋，肺組織病理切片待測。

取右肺下葉組織，黃豆粒大小，用4 ℃生理鹽水漂洗血跡，放入DEPC處理過的2 mL凍存管內，投入液氮罐保存，RT-PCR待測。

1.6 指標檢測

切片肺組織進行HE染色；IL-13進行ELISA檢測；STAT6進行RT-PCR檢測，操作均嚴格按照試劑盒說明進行。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 行為和體征

空白組：大鼠呼吸平穩，反應靈敏，毛色光澤，飲食、二便正常。模型組：激發后大鼠呼吸急促、喘息、抓耳撓腮，連續激發后毛色干枯、脫落，反應遲鈍，行動遲緩，飲食減少，大便不調。針刺組和艾灸組：經過針灸治療，大鼠呼吸急促、喘息、抓耳撓腮癥狀明顯減輕，毛色光澤度較好，行動較前靈敏，飲食較前增加，二便趨于正常。

2.2 HE染色結果

空白組大鼠支氣管管腔規整，黏膜無明顯水腫，未見到淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等炎性細胞的浸潤。模型組大鼠肺組織中可見支氣管管壁及平滑肌增厚、管腔狹窄，可見大量的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤。艾灸組大鼠支氣管管腔基本規整，基底膜稍有增厚，可見少量炎性細胞的浸潤。針刺組大鼠支氣管管腔基本正常，基底膜稍有增厚，偶見嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤。具體見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結果(×400)

2.3 血清IL-13含量表達

空白組大鼠血清中IL-13表達量很少;模型組大鼠IL-13表達較多，與空白組比較P<0.05，差異具有統計學意義;針刺組和艾灸組大鼠血清中IL-13表達量明顯減少，與模型組相比P<0.05，差異均具有統計學意義;針刺組與艾灸組相比P>0.05，差異無統計學意義。結果見表1。

表1 各組大鼠血清中IL-13含量表達比較

2.4 肺組織STAT6 mRNA表達

空白組大鼠肺組織中STAT6 mRNA表達量很少;模型組大鼠STAT6 mRNA表達較多，與空白組比較P<0.05，差異具有統計學意義；針刺組和艾灸組大鼠肺組織STAT6 mRNA表達量明顯減少，與模型組相比P<0.05，差異均具有統計學意義;針刺組與艾灸組相比P<0.05，差異具有統計學意義。結果見表2。

表2 各組大鼠肺組織STAT6 mRNA表達的比較

3 討論

哮喘是由多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥性疾病，其中Th1與Th2的失衡是哮喘發病的重要環節[3]。Th2炎癥因子的異常表達在哮喘發病中起重要作用，Th2可分泌多種白介素，如IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子，促進肥大細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞生長和分化，誘導哮喘發作[9]。

中醫學認為，哮喘的病因包括六淫侵襲機體的外因和飲食、勞倦、七情內傷等的內因。病機包括痰飲內伏、外邪侵襲、氣滯血瘀等邪實及肺、脾、腎三臟機能衰退等正虛兩個方面。肺俞屬足太陽膀胱經，內應肺臟，是肺臟精氣輸注于背部的腧穴，《素問·咳論》曰：“治臟者，治其俞”，具有調理肺氣、止咳平喘，祛風邪、實腠理之功。邵經明教授通過對肺俞、大椎、風門三穴正交實驗[10]，證實肺俞穴平喘效果最佳。大椎又名“諸陽之會”，為督脈穴，可通上達下，宣通一身之陽氣，通調振奮督陽，有疏風解表、通陽散寒、宣肺降逆、理氣平喘之功。風門屬足太陽膀胱經，為外邪侵襲人體之門戶，針之有疏散風寒、清瀉邪熱、調理肺氣、止咳平喘、實腠固表之效。三穴同用，發作期能夠降低氣道阻力，有理肺降逆、止咳平喘之效；緩解期能夠改善肺功能，益肺固衛，增強體質，預防發作，鞏固遠期療效。

白介素-13(IL-13)是一個具有代表性的Th2型細胞因子,被認為是哮喘發病中最重要的細胞因子之一。具有介導Th2應答的功能，在支氣管哮喘T細胞免疫反應及炎癥反應中發揮著重要作用。IL-13能夠不依賴于IgE和嗜酸粒細胞而單獨誘導產生過敏性哮喘的病理生理改變，IL-13還可抑制Eos、B淋巴細胞的凋亡,從而使氣道炎癥的持續時間延長[11]。

信號轉導和轉錄激活因子(signal transducer and activatorof transcription，STAT)6是Th2細胞的特異性轉錄因子，可促進Th2分泌IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子[12]。通過JAK/STAT信號通路介導IL-4、IL-5、IL-13誘導的基因表達，促進IgE生成，導致哮喘發作[13]。STAT6的持續活化和過度表達會促進Th2的募集、增殖及Th2型細胞IL-4、IL-13的優勢表達，從而導致Th1/Th2的失衡，而IL-13能誘導STAT6激活，從而趨化EOS等細胞向炎癥部位聚集，引起氣道炎癥反應及氣道高反應性[14]。

本實驗研究觀察血清中IL-13及肺組織中STAT6的表達變化影響，結果顯示，模型組大鼠血清中IL-13及肺組織中STAT的表達明顯高于空白組，提示IL-13及STAT6與哮喘的氣道炎癥的發生具有內在聯系，針刺組及艾灸組大鼠血清中IL-13及肺組織中STAT6的表達明顯降低，說明針刺、艾灸治療均可以改善哮喘模型大鼠肺組織的炎癥浸潤狀態以及肺間質結構的破壞。說明針灸“肺俞”“大椎”“風門”能明顯降低哮喘模型大鼠血清中IL-13及肺組織中STAT6的陽性表達，有效改善氣道炎癥，這可能是針灸改善哮喘癥狀，治療哮喘的作用機制之一。