化纖膠囊2號通過調控氧化應激緩解膿毒癥誘導的大鼠心肌損傷

吳麗麗，梁群

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

膿毒癥是機體感染后炎癥反應失控，出現過強、過激的多器官功損傷[1],經充分補液與治療仍舊存在難治循環障礙的膿毒癥休克，病死率高達30%～40%[2]，而此時循環障礙多由心臟泵功能衰竭引起[3]。膿毒癥誘導心肌損傷時冠脈血流的充盈并沒有減少，反而隨著膿毒癥的病情加重，冠脈血流有增加，這意味著心肌存在實質損傷[4]。膿毒癥過程中細菌產生的毒素，尤其內毒素——脂多糖,可以激活前哨巨噬細胞及肥大細胞釋放炎性細胞因子白介素-1前體(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[5]，激活機體免疫反應及吞噬作用[6]。其中嗜中性粒細胞是最主要的殺傷細胞，嗜中性粒細胞由血中游走到感染組織后進一步被激活成為吞噬細菌，在胞內形成吞噬溶酶體，通過強大的呼吸暴發作用殺滅細菌。呼吸暴發為激活的中性粒細胞增加耗氧量產生大量氧自由基，氧自由基可破壞多糖、氧化蛋白質、氧化不飽和脂肪酸，但殺傷細菌的同時還可通過脂質過氧化損傷機體的細胞膜及細胞器[7]。膿毒癥通過增強炎癥反應、自由基的產生、氧化應激和細胞凋亡誘導心肌損傷[8]。內源性抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)能加速氧自由基的清除，其活性的降低可進一步加重心肌損傷[9]。本研究從氧化應激的角度探討化纖膠囊2號對膿毒癥后心肌的保護作用，為尋找中醫藥防治膿毒癥心功能障礙提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠,體質量200～230 g，購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心,飼養條件為濕度(60±5)%，溫度(24±3)℃，光、暗循環12 h。本研究的所有方案均經黑龍江中醫藥大學動物倫理委員會批準。大鼠適應性喂養3 d后進行實驗。

1.2 實驗分組

取大鼠隨機分為對照組8只;膿毒癥組(CLP組)16只，其中12、24 h每組各8只;膿毒癥+化纖膠囊2號組(CLP+化纖膠囊2號組)16只，其中12、24 h每組各8只。

1.3 實驗造模

使用CLP方法誘導膿毒癥大鼠模型，腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，腹中線切開2～3 cm暴露盲腸，用4-0絲在盲腸中部結扎，隨后用18號針在結扎下方穿孔2次，使糞便從穿孔中流出，確保穿刺效果，將盲腸縫合于腹腔內位置后閉合腹部。對照組進行手術，不結扎、不穿刺盲腸。連續1周。觀察大鼠的一般狀態，記錄大鼠體溫、呼吸等生命體征；繪制生存曲線建立膿毒癥心肌損傷模型。

1.4 實驗藥品

化纖膠囊2號方組成如下：黃芪、 紅花、桃仁、制附子制、丹參、當歸、赤芍、熟大黃、茯苓、白術、黨參、川芎、生地黃、北沙參、麥冬、白芍、蛤蚧粉和炙甘草等。

藥物制備：取上述中藥，參照《中華人民共和國藥典》(2005版)中藥膠囊劑制作方法，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室制備化纖膠囊，規格為0.75 g/粒。具體制備過程為：稱取所有中藥飲片(生藥量105 g)，加入14倍量的蒸餾水，煎煮3次。每次煮沸后再文火煎煮1 h，后用紗布過濾，將得到的3次藥液合并，加壓濃縮為稠膏狀，再制成凍干粉,灌裝膠囊。實驗時用無菌蒸餾水將化纖膠囊2號內容物稀釋，至濃度為20 mg/mL。

1.5 給藥方式

對照組：按照對照組造模方法處理后灌腸給予0.9%生理鹽水10 mL/kg。

膿毒癥組(CLP組)：造模后灌腸給予0.9%生理鹽水10 mL/kg。

膿毒癥+化纖膠囊2號組：造模后給予灌腸給藥(0.9%生理鹽水+化纖膠囊2號10 mL/kg)。

1.6 觀測指標

模型制備后于12 h、24 h各時間，取血進行各項檢測。取靜脈血注入試管中立即離心(3 000 r/min)，收集血清存放于-70 ℃冰柜內待檢，檢測炎癥肌心肌酶學指標。24 h后處死進行心肌組織勻漿，提取蛋白以備用，觀測氧化應激指標。

1.6.1 炎癥因子的測定

采用ELISA試劑盒，根據試劑盒生產廠家說明，測定心肌損傷大鼠血清中IL-1β、TNF-α的水平。

1.6.2 心肌酶的測定

每只大鼠取血后，血液3 500 r/min離心30 min。分別用不同的試劑盒測定血清中LDH和CK-MB的水平。

1.6.3 氧化應激標志物的評估

通過ELISA試劑盒測定丙二醛(MDA)水平、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)活性等心肌組織中氧化應激水平。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠炎癥因子IL-1β、TNF-α水平比較

與對照組相比，CLP組大鼠血清炎癥因子水平明顯升高(P<0.01)；與CLP組相比，CLP+化纖膠囊2號組中炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平顯著降低(P<0.01)。結果見表1。

表1 各組大鼠炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平比較

2.2 各組大鼠心肌酶血清中LDH和CK-MB的水平比較

與對照組相比，CLP組LDH和CK-MB水平明顯提高(P<0.01)，而化纖膠囊2號治療逆轉了膿毒癥心肌損傷大鼠血清心肌酶的水平(P<0.01)。結果見表2。

表2 各組大鼠心肌酶血清中LDH和CK-MB的水平比較

2.3 各組大鼠氧化應激損傷指標丙二醛(MDA)水平比較

與對照組相比，CLP組心肌組織中MDA水平明顯升高(P<0.01)；而化纖膠囊2號可抑制膿毒癥致心肌損傷大鼠心肌組織中MDA水平升高(P<0.01)。結果見表3。

表3 各組大鼠氧化應激損傷指標丙二醛(MDA)水平比較

2.4 各組大鼠抗氧化酶胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平比較

與對照組相比，CLP組心肌組織中SOD和GPX活性降低(P<0.01)；而化纖膠囊2號可以增強膿毒癥致心肌損傷大鼠心肌組織中SOD和GPX活性(P<0.01)。結果見表4。

表4 各組大鼠GPx和SOD水平比較

3 討論

膿毒癥患者血清LDH水平可在一定程度反應患者能量代謝狀態，作為膿毒癥患者休克判定的參考指標和早期病死率的有效預測指標[10-11]。IL-1β、TNF-α可反應機體感染早期炎癥水平[12]。丙二醛(MDA)是細胞膜上多不飽和脂肪酸受到自由基攻擊后產生的脂質過氧化產物，MDA增高提示氧化應激增加[13]。谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)屬于機體抗氧化酶，能夠清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。MDA、SOD和GPx結合多用于評價機體的氧化應激及抗氧化情況[14]。膿毒癥會導致包括心肌組織損傷在內的多器官功能障礙，對膿毒癥的治療是一個挑戰。本研究測定膿毒癥心肌損傷大鼠血清炎癥因子、血清心肌酶水平，測定心肌損傷大鼠心肌組織氧化應激損傷及抗氧化水平功能，確定了化纖膠囊2號對膿毒癥心肌損傷的保護作用。在CLP組大鼠中，炎癥的發生是由于炎癥因子的增加，而化纖膠囊2號的治療改善了炎癥因子水平。炎癥因子、氧化應激激活導致包括心肌組織在內的不同器官的損傷。增加抗氧化繼而降低氧化應激反應可以防止心肌組織的損傷，本研究證實，化纖膠囊2號治療可以抑制氧化應激增強水平。

化纖膠囊 2 號以“化纖膠囊”為研發基礎進行化裁而來。考慮膿毒癥合并心肌損傷伴有因全身血液高度濃縮引發的凝血功能異常，以及因血液組分外滲導致的水腫等臨床癥狀，故經辨證后在原方的基礎上結合“桃紅四物湯”“當歸補血湯”“真武湯”等經典方劑進行改進。方中黃芪、紅花、桃仁、附子共為君藥，具有益氣活血、扶正固本、溫陽利水的作用[15-17]。

綜上所述，越來越多的證據表明，膿毒癥誘發的心肌損傷可增加膿毒癥的病死率。心臟是膿毒癥早期和漸進方式受到深刻影響的器官之一[18]。膿毒癥引起的心肌功能障礙(SIMD)機制并非冠狀動脈血流不足導致的整體性心肌缺血[19]。而是由于膿毒癥期間機體對炎癥的過強、過激反應[20-21]，及中性粒細胞吞噬細菌的呼吸暴發中產生大量氧自由誘導心肌損傷。研究顯示冠狀動脈血流分布不均、內皮損傷、血管內纖維蛋白沉積和中性粒細胞浸潤導致心臟微循環障礙[22]，而氧化應激可引起心肌的不可逆損傷[23]。因此，膿毒癥經充分補液與治療后，心臟微循環恢復，仍舊會存在難治的循環障礙，目前已證實膿毒癥后存在的心肌實質損傷引起心臟功能下降[24]。本研究應用具有益氣活血、扶正固本、溫陽利水作用的中藥化纖膠囊2號治療膿毒癥誘導心肌損傷大鼠，并通過監測早期炎癥因子、心肌酶及氧化應激水平的變化，證實了化纖膠囊2號具有減輕膿毒癥的炎癥反應作用，還能降低膿毒癥誘導的心肌損傷大鼠的氧化應激水平，由此達到保護膿毒癥誘導的心肌損傷的目的。