Hippo信號通路關鍵蛋白YAP調控巨噬細胞極化的分子機制研究

曾凱，王欣冉，杜雪

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院重癥醫學科，黑龍江 哈爾濱 150000)

巨噬細胞是重要的天然免疫細胞，可以發生不同水平的活化狀態，形成不同的極化類型，即 M1 型極化(介導促炎和殺傷)和 M2 型極化(介導抑炎和修復)，且巨噬細胞極化是其發揮免疫穩態調控功能的重要形式[1-2]。由于巨噬細胞在微環境穩態調控中發揮重要的作用，若巨噬細胞的極化失衡，可導致微環境內免疫穩態平衡被破壞，引發多種免疫相關性疾病[3-4]。因此，尋找巨噬細胞極化的調控靶點，深入探討其調控機制，對于靶向巨噬細胞的免疫干預意義重大。Hippo通路是細胞增殖、存活、分化和維持組織穩態的有效調節通路[5-6]，而YAP既是Hippo信號通路中的關鍵蛋白，也是一種重要的免疫調控分子[7]。目前，尚無有關YAP對巨噬細胞極化的作用和機制詳細報道，本研究旨在探討Hippo信號通路關鍵蛋白YAP調控巨噬細胞極化的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人單核細胞系THP-1細胞購于ATCC，RPMI 1640培養基購自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清購自天津康源生物技術有限公司；佛波酯(PMA)、脂多糖(LPS)、白細胞介素-4(IL-4)購自美國Sigma公司；FITC-CD86、PE-CD206抗體購自美國BD公司；YAP表達質粒、包含無序基因片段的對照質粒及YAP、IL-1β、CCL22、β-actin的引物由大連寶生物有限公司合成；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、PCR Master Mix試劑盒購自大連大連寶生物有限公司；TNF-α和TGF-β酶聯免疫吸附試劑盒購自美國eBiosicence公司；兔抗人YAP抗體、兔抗人IL-1β抗體、兔抗人CCL22抗體、兔抗人GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 THP-1細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養，培養條件為37 ℃、5% CO2飽和濕度，待細胞處于80%融合時進行傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 M1型和M2型巨噬細胞誘導 將處于對數生長期的THP-1細胞在含200 ng/mL佛波酯(PMA)、10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養48 h貼壁后，棄去培養液，1×PBS洗滌3次，誘導成為M0巨噬細胞作為對照組，然后將細胞繼續在含500 ng/mL脂多糖(LPS)、10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養24 h，誘導為M1型巨噬細胞，在含20 ng/mL 白細胞介素-4(IL-4)、10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養24 h，誘導為M2型巨噬細胞。

1.2.3 細胞轉染 取對數生長期的M1型巨噬細胞接種于6孔板，嚴格按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒操作說明書將慢病毒包裝的YAP表達質粒(YAP表達質粒組，上游引物序列:5’-CCTGCGTAGCCAGTTACCAA-3’、下游引物序列:5’-CCATCTCATCCACACTGTTC-3’)、慢病毒包裝的無序對照質粒(對照質粒組，上游引物序列:5’-CACCAAGCGAGGACTGAGCAT-3’、下游引物序列:5’-GCCAGACCCAGAAGGAGAAGC-3’)及慢病毒空載體(空載體組)轉染至靶細胞，48 h后，應用實時定量PCR法檢測轉染細胞中YAP表達水平，收集細胞進行后續實驗。

1.2.4 流式細胞術檢測 M1型和M2型巨噬細胞標志物水平 收集誘導的各組細胞，細胞密度為5×105個/mL，每管加入500 μL細胞懸液，分別加入FITC-CD86、PE-CD206抗體和同型對照抗體，經室溫避光孵育30 min 后，洗滌、棄上清，加入500 μL磷酸鹽緩沖液上機檢測。

1.2.5 酶聯免疫吸附法檢測 M1型和M2型巨噬細胞特異性分泌因子水平 收集誘導的各組細胞培養上清液，嚴格按照TNF-α和TGF-β酶聯免疫吸附試劑盒說明書進行操作，采用THERMO公司的BIOTEK酶標儀在450 nm處檢測吸光度值，根據標準曲線(y=0.824-0.762x，r2=0.967)，計算各組上清液中TNF-α和TGF-β水平。

1.2.6 實時定量PCR檢測mRNA表達水平 收集各組細胞，采用TRIzol法提取細胞總mRNA，按照逆轉錄試劑盒操作說明書進行逆轉錄反應合成cDNA，產物4 ℃保存備用。使用7500型實施定量PCR檢測儀進行實時PCR擴增反應，YAP mRNA上游引物序列：5’-CCTGCGTAGCCAGTTACCAA-3’、下游引物序列：5’-CCATCTCATCCACACTGTTC-3’；CCL22 mRNA上游引物序列5’AGGATGCGTGACTT

TGTG3’、下游引物序列:5’GTATCTACTATTGCGAGG

TG3’；IL-1β mRNA上游引物序列：5’-GACACATGGGATAACGAGGC-3’、下游引物序列：5’-ACGCAGGACAGGTACAGATT-3’；β-actin mRNA上游引物序列：5’-TACAACTCCTTGCAGCTCC-3’、下游引物序列：5’-ATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3’，以β-actin作為內參基因，最后采用2-△△CT方法計算目的基因mRNA表達水平。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達 收集各組細胞，經超聲破碎后，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，進行SDS-PAGE電泳，并濕轉至硝酸纖維素膜上，奶粉封閉2 h，加入已稀釋的一抗( 兔抗人YAP 抗體1∶500、兔抗人CCL22抗體1∶1 000、兔抗人IL-1β抗體1∶1 000、兔抗人β-actin抗體抗體1∶8 000)，4 ℃過夜；次日，經洗滌后，加入二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG1∶40 000)，室溫孵育2 h；經TBS-T洗滌后，使用化學發光底物試劑檢測目的蛋白，并曝光X線膠片，使用mage J軟件對蛋白條帶進行灰度分析，以GAPDH為內參蛋白。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 M1型和M2型巨噬細胞誘導結果

流式細胞術檢測結果顯示，M1型巨噬細胞組CD86+細胞比例[(47.89±6.32)%]及M2型巨噬細胞組CD206+細胞比例[(70.2±78.93)%]高于對照組[(3.09±0.28)%，(6.56±0.43)%]，差異均有統計學意義(P<0.05)；酶聯免疫吸附法檢測結果顯示，M1型巨噬細胞組培養上清液中TNF-α水平高于對照組和M2型巨噬細胞組，M2型巨噬細胞組培養上清液中TGF-β水平高于對照組和M1型巨噬細胞組，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示M1型和M2型巨噬細胞誘導成功。見圖1-圖3。

2.2 YAP在M1型和M2型巨噬細胞中的表達比較

實時定量PCR檢測結果顯示，YAP在M1型巨噬細胞中的表達水平低于M2型巨噬細胞(P<0.05)，見圖4；Western blot檢測結果顯示，YAP在M1型巨噬細胞中的表達水平低于M2型巨噬細胞(P<0.05)，提示YAP可能與M2型巨噬細胞的表型維持有關。見圖5。

2.3 YAP抑制M1表型形成和促進M2表型形成比較

流式細胞術檢測結果顯示，空載體組、對照質粒組、YAP表達質粒組CD86+細胞比例分別為(46.5±17.03)%、(45.5±85.92)%、(26.4±78.02)%，空載體組、對照質粒組、YAP表達質粒組CD206+細胞比例分別為(13.27±2.46)%、(14.0±21.87)%、(53.62±10.35)%，YAP表達質粒組CD86+細胞比例低于空載體組和對照質粒組，而CD206+細胞比例高于空載體組和對照質粒組，差異均具有統計學意義(P<0.05)，圖6；實時定量PCR檢測結果顯示，與對照質粒組相比，YAP表達質粒組中，M1型巨噬細胞標志物IL-1β mRNA表達水平降低(P<0.05)，M2型巨噬細胞標志物CCL22 mRNA表達水平升高(P<0.05)，圖7；Western blot檢測結果顯示，與對照質粒組相比，YAP表達質粒組中，M1型巨噬細胞標志物IL-1β 蛋白表達水平降低(P<0.05)，M2型巨噬細胞標志物CCL22蛋白表達水平升高(P<0.05)，提示YAP可能抑制M1型巨噬細胞的形成和促進M2表型形成，圖8。

3 討論

巨噬細胞是一種具有較強可塑性和功能異質性的免疫細胞，其可在不同刺激因素的作用下，分化成不同表型進而發揮不同的生物學作用[8]。研究[9-10]顯示，在干擾素或脂多糖的刺激下，巨噬細胞可向M1型方向極化，而在白介素4或白介素3的刺激下，巨噬細胞可向M2型方向極化。M1型巨噬細胞具有殺傷病原體和抗腫瘤免疫反應的作用[11]，而M2型巨噬細胞具有抑制免疫應答的能力[12]。巨噬細胞極化是巨噬細胞發揮免疫穩態調控功能的重要形式，若極化失衡，則可引起免疫穩態紊亂，導致疾病發生[13-14]。因此，尋找巨噬細胞極化的調控靶點，深入探討其調控機制，對于靶向巨噬細胞的免疫干預意義重大。

Hippo通路是細胞增殖、存活、分化和維持組織穩態的有效調節通路[15-16]。研究[17]顯示，YAP是Hippo信號通路的關鍵蛋白，其可作為轉錄共激活分子促進腫瘤細胞的增殖。另有研究[18]發現，YAP 還可誘導趨化因子2的表達，協助腫瘤細胞發生免疫逃逸。最近還有研究[19]發現，YAP 能促進腫瘤細胞釋放炎癥因子，同時招募腫瘤相關巨噬細胞。然而，目前有關YAP對巨噬細胞極化的作用和機制的研究極少。

本研究首先通過PMA誘導THP-1細胞成為巨噬細胞，再經脂多糖誘導為M1型巨噬細胞，經白介素-4誘導為M2型巨噬細胞，并通過流式細胞術檢測了M1型巨噬細胞標志物CD86+M2型巨噬細胞標志物CD206的表達，通過酶聯免疫吸附法檢測M1型巨噬細胞特異性分泌因子TNF-α和M2型巨噬細胞特異性分泌因子TGF-β水平，結果提示M1型和M2型巨噬細胞模型建立成功。為了確認YAP與巨噬細胞極化的關系，本研究應用誘導成功的M1型和M2型巨噬細胞，檢測YAP在不同表型巨噬細胞中的表達差異，結果發現，無論在mRNA水平還是蛋白水平，YAP在M1型巨噬細胞中的表達均低于M2型巨噬細胞，提示YAP可能與M2型巨噬細胞的表型維持有關。為了進一步確認YAP在巨噬細胞極化中的作用，本研究將YAP表達質粒轉染至M1型巨噬細胞，結果發現，在M1型巨噬細胞中過表達YAP，可抑制M1型巨噬細胞標志物IL-1β mRNA和蛋白的表達水平，但同時可增加M2型巨噬細胞標志物CCL22 mRNA和蛋白的表達水平，提示YAP可能抑制M1型巨噬細胞的形成和促進M2表型形成。

綜上所述，Hippo信號通路關鍵蛋白YAP表達高低可調控巨噬細胞極化，YAP表達升高可抑制M1型巨噬細胞的形成和促進M2表型形成。