TP53 與Wnt-5a 在甲狀腺癌中表達(dá)分析及臨床分期的指導(dǎo)意義

趙長(zhǎng)海，張辰銘，孫春陽(yáng)，郭文博，王 強(qiáng)，焦成斌

（1.佳木斯市中心醫(yī)院普外科，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，黑龍江 佳木斯 154002）

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）是一種內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，以女性較為多見(jiàn)，其中90%以上為分化型甲狀腺癌[1，2]。近年來(lái)對(duì)甲狀腺癌的研究表明多種基因表達(dá)異常與其惡性生物學(xué)特點(diǎn)密切相關(guān)，然而對(duì)于甲狀腺癌的具體發(fā)病分子機(jī)制尚未完全明確。人類(lèi)P53 位于染色體17p13.1，目前已證實(shí)其在多種進(jìn)展期、轉(zhuǎn)移性腫瘤（腦腫瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等）中發(fā)生高頻率突變或缺失是一種普遍現(xiàn)象[3]。突變型P53 具有抑制野生型P53 的功能，可使DNA的修復(fù)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、調(diào)節(jié)代謝等腫瘤抑制功能喪失，同時(shí)還可促進(jìn)腫瘤成形，這種突變體被稱(chēng)為T(mén)P53[4]。人類(lèi)Wnt-5a 位于染色體3p14-21，是人體生長(zhǎng)發(fā)育和病理修復(fù)過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵因子，研究表明[5，6]，各種蛋白質(zhì)能結(jié)合細(xì)胞膜表面不同的Wnt-5a 受體，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)中參與細(xì)胞的分裂與凋亡。目前有關(guān)TP53、Wnt-5a 在甲狀腺癌中表達(dá)模式及其與甲狀腺癌臨床病理分期關(guān)系的研究較少，基于此，本研究主要分析不同臨床分期的甲狀腺癌中TP53 和Wnt-5a 的表達(dá)特點(diǎn)，探討其在甲狀腺癌中表達(dá)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2004 年7 月～2013 年9 月佳木斯市中心醫(yī)院經(jīng)過(guò)病理證實(shí)的50 例甲狀腺癌組織、10 例癌旁正常腺體組織的石蠟標(biāo)本及23 例甲狀腺癌組織、10 例癌旁正常腺體組織的新鮮標(biāo)本。石蠟標(biāo)本中男性15 例，女性35 例，年齡20～77 歲，中位年齡41 歲；手術(shù)新鮮組織標(biāo)本中男性13 例，女性20 例，年齡27～67 歲，中位年齡52 歲；依據(jù)美國(guó)腫瘤聯(lián)合協(xié)會(huì)（AJCC）進(jìn)行臨床分期[7，8]：石蠟標(biāo)本中甲狀腺癌Ⅰ～Ⅱ期14 例、Ⅲ～Ⅳ期36 例。新鮮組織標(biāo)本中甲狀腺癌Ⅰ～Ⅱ期7 例、Ⅲ～Ⅳ期16 例。

1.2 主要試劑及器材 TP53 突變兔抗人多克隆抗體從上海蘭頓生物技術(shù)股份有限公司購(gòu)買(mǎi)，兔抗人的Wnt-5a 多克隆抗體購(gòu)自上海蘭頓生物科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒購(gòu)自北京翰譜醫(yī)藥生物研究所。β-actin、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG 抗體、BCA、SDS-PAGE kit、考馬斯亮藍(lán)染色液、DNA和蛋白電泳標(biāo)記Marker，ECL 超敏反應(yīng)發(fā)光液、純硝酸纖維素膜、麗春紅染色被購(gòu)自北京博奧生物有限公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、PCR 儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司型號(hào)：9800）、分析軟件和凝膠圖像分析系統(tǒng)BTNTA2020D（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。PBS 1 L、0.01 mol/L 檸檬酸鹽液、0.5 mol/L EDTA 緩沖液（pH 8.0）、1 mol/L 的TBS 緩沖液（pH 8.0）、酶消化液、封片劑。通過(guò)NCBI 中GeneBank 搜索框查詢(xún)到P53 的order cDNA 框中顯示P53 引物5-TCTGTCACTTGCACGTACTC-3，下游引物：5 端-CACGGATGTGAAGGGTGAAA-3 端。Wnt-5a 引物序 列：5-GACCTGGTCTACAT-CGACCCC-3 端，5端-GCAGCACCAGTGGAACTTGCA-3 端，引物合成由上海生物工程公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為348 bp、214 bp。β-actin 上游引物：5 端-ACCACCATGTACACAGGCAT-3 端，下游引 物：5 端-CTCTCTTTGCACTCACTAGGGG-3 端，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為150 bp。

1.3 免疫組織化學(xué) SP 法：①脫蠟、水化；②PBS 洗2～3 次，各5 min；③3%二氧化氫滴加在切片上，室溫下放置10 min 左右；④PBS 洗2～3 次，各5 min；⑤微波爐中抗原修復(fù)；⑥PBS 洗2～3 次，各5 min；⑦在每張病理切片中滴加適量的山羊血清封閉液，室溫放置19 min，甩去多余液體；⑧滴加相應(yīng)需要檢測(cè)的TP53或Wnt-5aⅠ抗50 μl，室溫環(huán)境下靜置1 h，4 ℃過(guò)夜或者37 ℃1 h；⑨4 ℃過(guò)夜后在37 ℃復(fù)溫45 min；⑩PBS 洗3 次，各5 min；每張切片中加入39～45 μlⅡ抗液，37 ℃條件下放置1 h；PBS 洗3 次，各5 min；DAB 液分別滴加D、A、B，5～10 min 后在顯微鏡下根據(jù)情況調(diào)整染色程度；PBS 或自來(lái)水沖洗10 min；染色結(jié)束后蘇木精復(fù)染3 min，后用鹽酸酒精分化；自來(lái)水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化染色結(jié)果判定：TP53 定位主要位于細(xì)胞核以染色結(jié)果目的蛋白出現(xiàn)黃或棕色顆粒為陽(yáng)性，陰性為陽(yáng)性細(xì)胞＜25%，陽(yáng)性為陽(yáng)性細(xì)胞＞25%，隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)1000 個(gè)細(xì)胞。

1.4 反轉(zhuǎn)錄PCR 總RNA 提?。孩偃?00 mg 組織，放到1.5 ml EP 管中，在低溫條件下加入1 ml Trizol剪碎；②對(duì)EP 管中的組織震蕩30 s；③加入0.3 ml體積的氯仿，均勻充分搖動(dòng)30 s 左右，室溫下放置3 min；④8000×g，4 ℃離心，15 min；⑤吸掉上層無(wú)色水相，然后移入另一無(wú)菌EP 管中（約0.6 ml）；⑥加等體積異丙醇，-20 ℃，30 min；⑦8000×g，4 ℃離心，10 min，在EP 管底部可見(jiàn)微量RNA 的沉淀；⑧去掉EP 管中上清液，加75%乙醇1 ml 后振蕩；⑨7500×g，4 ℃離心，10 min；⑩棄上清，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5～10 min；沉淀溶于20 μl DEPC 水，取1 μl 加入79 μl DEPC 水測(cè)OD260/OD280；計(jì)算濃度與純度，-70 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反應(yīng)體系：氯化鎂、buffer、RNase-free dH2O、dntp、混合液、RNase 抑制劑、amv RNA transrciptase、random9 mers、positive control RNA 總體積10 μl，離心后反應(yīng)條件：30 ℃、41 ℃、95 ℃、5 ℃。PCR 反應(yīng)：加入PCR 目的基因引物、模版cDNA、RNA tap 聚合酶、PCR buffer、滅菌蒸餾水，總反應(yīng)體積13 μl，混勻快速離心1 次，反應(yīng)條件：95 ℃、94 ℃、95 ℃、57 ℃、71 ℃、72℃，共35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物-20 ℃冰箱保存取PCR 產(chǎn)物8 μl 加5×Loading Buffer 2 μl 2%，通過(guò)110 V，95 mA 的電泳后，采用相應(yīng)的染色劑（溴化乙錠）對(duì)跑完后電泳的凝膠進(jìn)行著色，凝膠成象儀成象之后在電腦桌面上點(diǎn)擊并保存，通過(guò)密度分析軟件對(duì)測(cè)出各泳帶的吸光度值，以目的基因和βactin mRNA 吸光度比值進(jìn)行mRNA 半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料進(jìn)行整理后錄入Excel 表格，采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)性分析甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 的關(guān)系。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP53 蛋白、Wnt-5a 蛋白在甲狀腺癌與癌旁組織中的表達(dá) 甲狀腺癌TP53 陽(yáng)性表達(dá)率為58.00%（29/50），高于癌旁組織的20.00%（2/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期TP53 陽(yáng)性表達(dá)率分別為35.71%（5/14）、66.67%（24/36），二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。甲狀腺癌Wnt-5a 陽(yáng)性表達(dá)率為40.00%（20/50），低于癌旁組的70.00%（7/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a 陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.29%（9/14）、30.56%（11/36），二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 TP53 在甲狀腺癌及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 Wnt-5a 在甲狀腺癌及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 TP53 mRNA、Wnt-5a mRNA 在甲狀腺癌與癌旁組織中的表達(dá)分析 甲狀腺癌TP53 mRNA 表達(dá)量為（0.54±0.040），高于癌旁組的（0.32±0.030），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌組Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期TP53 mRNA 表達(dá)量分別為（0.48±0.022）、（0.58±0.032），二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。甲狀腺癌Wnt-5a mRNA 表達(dá)量為（0.51±0.079），低于癌旁組的（0.79±0.028），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a mRNA 表達(dá)量分別為（0.71±0.036）、（0.50±0.053），二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 的關(guān)系Pearson 相關(guān)性分析顯示，甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.720，P＜0.05）。

3 討論

P53 是一個(gè)癌癥抑制蛋白質(zhì)，在腫瘤調(diào)控過(guò)程中以及人體代謝、發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。目前TP53 在國(guó)內(nèi)的研究主要集中在卵巢癌，肺腺癌、肝癌、乳腺癌/三陰乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胃癌等惡性腫瘤中的蛋白表達(dá)特性，研究認(rèn)為[9-12]，P53 和VEGF、P16、PAX2、PTEN、VHL、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原、細(xì)胞周期素、缺氧誘導(dǎo)因子-1α、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白、Mir-34 家族在腫瘤中協(xié)同表達(dá)，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞復(fù)雜的生物學(xué)特性，但是卻較少?gòu)男盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度研究P53 與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系。有研究報(bào)道[13]，TP53 對(duì)ID4 基因表達(dá)具有促進(jìn)作用。人類(lèi)Wnt-5a轉(zhuǎn)錄并翻譯生成的成熟蛋白是人體生長(zhǎng)發(fā)育和病理修復(fù)過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵因子，并參與細(xì)胞變化調(diào)控，若Wnt-5a 異常變化則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖特性改變，進(jìn)而出現(xiàn)增殖失控或增殖抑制。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)和RT-PCR 在蛋白和mRNA 層面檢測(cè)甲狀腺癌中的TP53 的表達(dá)，結(jié)果顯示甲狀腺癌TP53 陽(yáng)性表達(dá)率為58.00%（29/50），高于癌旁組織的20.00%（2/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期TP53 陽(yáng)性表達(dá)率分別為35.71%（5/14）、66.67%（24/36），二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示高表達(dá)TP53 蛋白參與或者在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用。此外，甲狀腺癌TP53 mRNA 表達(dá)量為（0.54±0.040），高于癌旁組的（0.32±0.030），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌組Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期TP53 mRNA 表達(dá)量分別為（0.48±0.022）、（0.58±0.032），二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這種mRNA 表達(dá)的差異性與蛋白表達(dá)差異和模式相同，提示甲狀腺癌TP53 的異常增高在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)層面參與了腫瘤的進(jìn)展。

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟多因素的過(guò)程，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)和RT-PCR 檢測(cè)在甲狀腺癌中的Wnt-5a 的差異表達(dá)，結(jié)果顯示甲狀腺癌Wnt-5a 陽(yáng)性表達(dá)率為40.00%（20/50），低于癌旁組的70.00%（7/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a 陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.29%（9/14）、30.56%（11/36），二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明Wnt-5a 在甲狀腺癌組的陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組陽(yáng)性表達(dá)率以及隨甲狀腺癌的高分期，其總體陽(yáng)性率較低。此外，甲狀腺癌Wnt-5a mRNA 表達(dá)量為（0.51±0.079），低于癌旁組的（0.79±0.028），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a mRNA 表達(dá)量分別為（0.71±0.036）、（0.50±0.053），二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且相關(guān)性分析顯示，甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.720，P＜0.05）。由于腫瘤分期越高往往提示腫瘤惡性程度以及侵襲性越高，這些結(jié)果顯示W(wǎng)nt-5a 在甲狀腺癌的發(fā)生過(guò)程中可能有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)細(xì)胞分化的作用。

綜上所述，TP53 和Wnt-5a 基因的表達(dá)參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)Wnt-5a 激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在臨床甲狀腺癌的治療中具有輔助作用，二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)臨床手術(shù)方式、術(shù)后治療策略選擇、預(yù)后評(píng)估具有重要的價(jià)值。