流感病毒檢測中細胞培養法與實時熒光定量PCR 法效果比較

王 穎

（天津市薊州區疾病預防控制中心檢驗科，天津 301900）

流行性感冒（influenza）是一種由于流感病毒導致的急性呼吸道傳染病，臨床中較為常見，具有傳播速度快、傳染范圍廣、發病率高等特點，流感患者發病后臨床癥狀主要表現為發熱、頭疼、寒戰、全身酸痛等，對患者的生命安全及生活質量造成了嚴重的威脅[1]。為了進一步了解流感病毒的流行株構成、基因特異性以及抗原性，預防流感的擴散，及時、有效的監測至關重要[2]。目前，臨床檢測流感病毒的方法較多，如膠體金快速檢測、細胞培養等[3，4]。實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）技術在1996 由美國研究人員發明，和傳統的PCR 技術相比，提高了其環保型，且具有自動化的特點，檢測特異度高[5]。該技術能夠通過擴增的方式，作用于每一個循環產物的熒光信號，從而提高信號的強度，當一個循環結束后，會被熒光強度信號收集，能夠通過熒光強度觀察產物量的變化，從而建立熒光擴增曲線圖[6]。因此，本次研究對比了細胞培養法與實時熒光定量PCR 法檢測流感病毒的效果，具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年10 月～2020 年10 月天津市薊州區疾病預防控制中心的604 例疑似流感樣本作為研究對象，所有樣本均在24 h 內送至實驗室進行檢測，無法在24 h 內送檢的樣本，置于-70 ℃的環境中保存。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 法 通過核酸提取盒實時熒光定量PCR 法提取樣本。ABI7500 Fast 實時熒光定量PCR 儀，由美國Thenmo 公司提供，核酸提取采用RNA 病毒提取試劑盒RNeasy Mini Kit，由德國QIAGEN 公司提供，PCR 反應試劑由碩世生物科技有限公司提供。擴增條件為在50 ℃下持續30 min，循環1 次后，在95 ℃下持續5 min，循環1 次后在95 ℃下持續10 s，然后在55 ℃下持續40 s，共進行45 個循環。最后熒光收集，并在55 ℃環境下實施熒光檢測。

1.2.2 細胞培養法 參考《流行性感冒診療方案（2018年版修訂版）》中規定的流感病毒的鑒定及分離操作。狗腎傳代細胞由天津市疾病預防控制中心提供。將10000 U/ml 雙抗置入樣本病毒培養液，觀察細胞發生的病理變化，并通過紅細胞凝集試驗檢測病毒培養液。當紅細胞凝集試驗的滴度達到1∶16 及以上時，采用紅細胞凝集抑制試驗對相關亞型，用標準血清進行檢測。

1.3 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，以細胞培養法的檢測結果作為金標準，計算實時熒光定量PCR 檢測法的靈敏度及特異度。計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR 法與細胞培養法陽性率比較實時熒光定量PCR 法陽性率高于細胞培養法，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 實時熒光定量PCR 法毒株分離情況 160 例流感陽性樣本中，共分離出毒株60 株，分離率37.50%；444 例流感陰性樣本中，共分離出毒株16株，分離率3.60%；實時熒光定量PCR 陽性樣本分離率高于陰性樣本分離率，差異有統計學意義（χ2=122.857，P=0.000）。

表1 實時熒光定量PCR 法與細胞培養法陽性率比較[n（%）]

2.3 實時熒光定量PCR 法靈敏度與特異度 以細胞培養法為金標準，實時熒光定量PCR 法檢測靈敏度為90.79%，特異度為98.42%，見表2。

表2 實時熒光定量PCR 法靈敏度與特異度

3 討論

流感病毒屬于RNA 病毒，在臨床中的發病率極高，且流感病毒的感染性較強，潛伏期短，傳染過程中還可能發生變異，危險性極高，一旦發生疏忽，極易導致流感爆發。因此，如何對流感病毒進行有效的預防及控制，是臨床有待解決的課題之一[3]。膠體金快速檢測敏感度較低，在單獨診斷及篩查中應用有限。而細胞培養法雖然是目前檢測流感病毒最可靠的方式之一，但檢測流程較為復雜，難以滿足快速診斷的需求，難以在基層推廣使用。實時熒光定量PCR不僅能夠有效解決PCR 造成的污染問題，同時還能夠實現自動化檢測，特異性較高，目前已經成為臨床監測流感病毒的“金標準”[5]。

本次研究結果顯示，細胞培養法共檢測出陽性76 株，陽性率12.58%；實時熒光定量PCR 法共檢測陽性160 例，陽性率26.49%。細胞培養法中，A 型H1亞型檢出7 例，A 型H3亞型31 例，B 型檢出38 例；實時熒光定量PCR 法中，A 型H1亞型檢出11 例，A型H3亞型76 例，B 型73 例。兩種方法陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=37.158，P=0.000）。160 例流感陽性樣本中，共分離出毒株60 株，分離率37.50%；444 例流感陰性樣本中，共分離出毒株16株，分離率3.60%。實時熒光定量PCR 陽性樣本與陰性樣本分離率比較，差異有統計學意義（χ2=122.857，P=0.000）。以細胞培養法為金標準，實時熒光定量PCR 法檢測靈敏度為90.79%（69/76），特異度為98.42%（437/444）。實時熒光定量PCR 計數的原理是在原來的反應體系中增加熒光報告基團與淬滅基團，在反應的過程中，擴增產物會逐漸上升，熒光信號越來越多，醫務人員可以根據對熒光信號的觀察，分析熒光信號的變化趨勢判斷PCR 進程的開展情況，再利用標準曲線進行定量分析。根據實時熒光定量PCR 法的特點，其反應過程可以分為三個階段：熒光背景信號、熒光信號指數擴增以及平臺期[7]。在第一個過程中，由PCR 反應產生的熒光信號較少，經常出現被覆蓋的情況，醫務人員難以明確產無量的具體變化；而在平臺期的反應過程中，擴增信號的數量無明顯變化，較為穩定。在熒光信號擴增的過程中，PCR 擴增產無量的指數與DNA 模板密切相關。為了便于分析，可以引入熒光閾值和閾值循環數（threshold cycle，Ct）兩個概念[8]。熒光閾值指的是醫務人員在曲線上假定的一個值，缺省設置為3～15個循環的熒光信號標準差的10 倍。Ct 值指的是在PCR 反應發生的過程中，不同反應罐呃逆熒光信號達到假定值所需要得循環次數。不同模板下，擴增時熒光數值存在一定的差異，且具有不可重復的特點，在Ct 值得輔助下有利于醫務人員重現PCR 反應過程[9]。根據PCR 定量達到原理，模板起始拷貝對數與閾值循環之間有密切的關系，隨著拷貝數的增加，所達到閾值需要的循環會有所下降，Ct 值也就越小[10]。因此，醫務人員可以根據起始的拷貝數繪制曲線，而熒光基團與PCR 擴增產物的數量有關，通過對熒光信號的收集與分析，即可得出Ct 值，從計算出未知樣品的起始拷貝數[11]。

近十幾年來，研究人員提出并詳細闡述了許多實時熒光定量PCR 方法。根據所用熒光物質的化學原理和PCR 檢測的特異性，可將其分為兩大類：第1 類是DNA 染料法，對特異性和非特異性的PCR擴增產物進行檢測[12]；第2 類是熒光探針法，將熒光素與寡聚核苷酸相連，對特異性的PCR 產物進行檢測。目前有多種雙鏈DNA 結合染料可用于實時熒光定量PCR，包括EB、SYBR GreenⅠ、SYBR Gold、Eva Green 等。其中最常用的染料是SYBR GreenⅠ，這種DNA 染料吸收藍光（λmax=497 nm）、發射綠光（λmax=520 nm），對DNA 雙鏈具有高親和力[13]。當它結合到雙鏈DNA 小溝部位時，會發出很強的熒光，在qPCR 延伸階段能夠被檢測到，具有較強的敏感性，并且不需要因模板不同而進行特別定制，操作簡易，相對于熒光探針類來說價格較低，因此被廣泛應用[14]。但是在qPCR 擴增過程中，非特異性擴增產物和引物二聚體也能與染料結合產生熒光信號，這種染料與雙鏈DNA 結合非特異性的特點會造成假陽性，從而影響定量的準確性，因此其特異性不如探針法[15]。針對這一問題，需要用熔解曲線鑒定擴增產物的特異性。熔解曲線分析是將樣品從50 ℃升高至95 ℃，并監測這一過程熒光信號的變化[16]。到達DNA 變性溫度時，染料分解導致熒光信號劇烈下降，非特異性產物和引物二聚體的變性溫度要比特異性產物低，故可以通過熔解曲線進行鑒別[17]。有研究者發現[18]，Eva Green 比SYBR GreenⅠ具有更強的穩定性和敏感性，Eva Green 在飽和的情況下可以產生更強的熒光信號，并且適合高分辨率的熔解曲線分析。熒光探針是將小分子熒光素結合到寡聚核苷酸上，在qPCR 進程中起探針的作用。目前已有多種不同激發光譜和發射光譜的熒光基團可以在qPCR 中使用[19]。

綜上所述，實時熒光定量PCR 法檢測流感病毒的應用較高價值，具有檢測速度高、靈敏度高、特異性高等優勢，可用于應急檢測、常規檢測等。細胞培養能夠獲取毒株，有利于進一步對病毒抗原性、基因特性以及耐藥性的研究。