不同類型腰椎退行性變患者椎間盤IL-6、IL-1β 和COX-2 的表達(dá)研究

王 健，王 剛，王可良

（天津市西青醫(yī)院骨一科，天津 300380）

腰椎退行性變（lumbar degeneration）是常見的骨科疾病，包含腰椎管狹窄癥、腰椎間盤突出癥、退行性腰椎滑脫、退行性脊柱側(cè)凸多種不同類型的疾病，其中腰椎管狹窄癥和腰椎間盤突出癥在臨床最為多見。腰椎管狹窄癥典型表現(xiàn)為間歇性跛行，腰椎間盤突出癥典型表現(xiàn)為下肢放射性疼痛。目前對(duì)腰椎間盤退變機(jī)制的研究很多，主要有化學(xué)性神經(jīng)根炎癥、機(jī)械性壓迫、椎間盤自身免疫等學(xué)說(shuō)，但對(duì)其確切的發(fā)病機(jī)制尚未明確[1-4]。腰痛和下肢神經(jīng)根性痛癥狀的嚴(yán)重程度不僅與腰脊髓神經(jīng)受突出間盤壓迫的位置及程度相關(guān)，一部分患者腰椎MRI 檢查可見腰脊髓神經(jīng)受壓嚴(yán)重，但臨床癥狀表現(xiàn)較輕。分子生物學(xué)研究證實(shí)[5，6]，退變椎間盤組織中多種炎癥因子的表達(dá)增高，進(jìn)一步研究證實(shí)，白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）及環(huán)氧化酶2（COX-2）等炎性因子可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并加快腰椎間盤的退變過(guò)程。基于此，本研究通過(guò)分析不同類型腰椎退行性變患者椎間盤組織中白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1β、環(huán)氧化酶2 表達(dá)的相關(guān)性和差異性，探討其在腰椎間盤退變過(guò)程中的作用，及其與癥狀嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為闡明腰椎間盤退變的發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017 年7 月～2018 年11 月于天津市西青醫(yī)院行腰椎后路間盤切除內(nèi)固定術(shù)的退變椎間盤組織（L2/3～L5/S1）標(biāo)本60 例，其中腰椎管狹窄癥組30 例，腰椎間盤突出癥組30 例。腰椎管狹窄癥組中男12 例，女18 例，年齡27～55 歲，平均年齡（48.12±8.40）歲。腰椎間盤突出癥組中男14 例，女16 例，年齡29～67 歲，平均年齡（50.24±10.18）歲。所有患者均符合腰椎管狹窄癥及腰椎間盤突出癥的典型臨床癥狀、體征，且與影像學(xué)檢查結(jié)果相符。另收集同時(shí)間段因外傷致腰椎骨折患者的椎間盤組織（L1/2～L3/4）30 例作為腰椎外傷組，其中男11 例，女19例，年齡23～58 歲，平均年齡（30.52±9.78）歲，均無(wú)腰椎外傷史及手術(shù)史，椎間盤Thompson’s 退變分級(jí)為1～2 級(jí)。腰椎間盤突出癥組及腰椎管狹窄癥組影像學(xué)表現(xiàn)為單節(jié)段或多節(jié)段的椎間盤突出，手術(shù)切除的椎間盤均為責(zé)任間盤。腰椎管狹窄癥組取得椎間盤節(jié)段，L2/35 例，L3/415 例，L4/525 例，L5/S123 例。腰椎間盤突出癥組取得椎間盤節(jié)段，L3/43 例，L4/512 例，L5/S115 例。腰椎外傷組取得椎間盤節(jié)段，L1/220 例，L2/39 例，L3/41 例。對(duì)所納入研究的患者術(shù)前均已履行告知義務(wù)，告知其術(shù)中切除的椎間盤組織將用于實(shí)驗(yàn)研究，取得其同意并簽署知情同意書，同時(shí)獲得天津市西青醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。本實(shí)驗(yàn)忽略納入的實(shí)驗(yàn)對(duì)象性別與年齡所產(chǎn)生的誤差。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本獲取 腰椎管狹窄癥組及腰椎間盤突出癥組行后入路腰椎間盤切除椎間植骨融合內(nèi)固定術(shù)，切除責(zé)任間盤作為標(biāo)本，椎間隙植骨并鎖緊內(nèi)固定物。腰椎外傷組行前入路腰椎間盤切除骨折復(fù)位椎間植骨融合內(nèi)固定術(shù)，切除部分椎間盤作為標(biāo)本，置入內(nèi)固定螺釘系統(tǒng)并撐開復(fù)位骨折，椎間隙內(nèi)植骨并鎖緊內(nèi)固定物。所有患者均由同一手術(shù)組醫(yī)生完成手術(shù)操作。將術(shù)中所得標(biāo)本以生理鹽水沖洗，去除其表面的碎骨、血液等非椎間盤組織，截取髓核與纖維環(huán)交界部位1 cm 標(biāo)本，1 h 內(nèi)以10%福爾馬林固定24 h，石蠟包埋后制備4 μm 的軟組織切片，0 ℃～4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 染色觀察 將得到的組織切片常溫二甲苯脫蠟4 min×3 次，脫蠟后的切片依次放置于濃度為100%、95%、90%、80%、70%的酒精中各5 min 梯度逐級(jí)水化，蒸餾水沖洗4 min×3 次。以3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，浸泡8 min，PBS 沖洗4 min×3 次。高壓高溫修復(fù)抗原，將切片置入枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）中，加熱至沸騰3 min，冷卻至室溫后用PBS 洗滌4 min×3 次。每張切片滴加適當(dāng)稀釋過(guò)的一抗，4 ℃過(guò)夜，用PBS 代替一抗作陰性對(duì)照；加入0.025% Triton/TBS 稀釋的二抗（HRP 標(biāo)記），37 ℃雜交2h，TBS 洗滌2 次，每次5min；DAB 室溫顯色10min，蘇木精復(fù)染1 min，自來(lái)水沖洗。在100 倍鏡下隨機(jī)選取6 個(gè)視野觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色、細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色為陽(yáng)性，觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度及是否有新生血管形成。白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、環(huán)氧化酶2 的表達(dá)情況按如下標(biāo)準(zhǔn)判定：在400 倍鏡下隨機(jī)選取20 個(gè)視野進(jìn)行觀察，細(xì)胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。所有使用的一抗購(gòu)于Abcam。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組免疫化學(xué)染色陽(yáng)性數(shù)據(jù)以（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病理表現(xiàn) 腰椎管狹窄癥組和腰椎間盤突出癥組椎間盤組織周圍的炎性肉芽組織中可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及新生血管形成，陽(yáng)性細(xì)胞以成纖維紐胞、軟骨細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主；腰椎外傷組未見明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及新生血管形成。免疫化學(xué)染色顯示，腰椎管狹窄癥組及腰椎間盤突出癥組中均可見白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，主要分布于椎間盤髓核、纖維環(huán)內(nèi)環(huán)及椎間盤周圍的炎性肉芽組織內(nèi)，在腰椎間盤突出癥組可見大量環(huán)氧化酶2 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，且在纖維環(huán)破裂髓核脫出的標(biāo)本中尤為顯著，在腰椎管狹窄癥組中相對(duì)較少，兩組中表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況與前基本相同；在腰椎外傷組中上述炎性因子表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞稀少，見圖1。

2.2 三組白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、環(huán)氧化酶2陽(yáng)性表達(dá)率比較 腰椎管狹窄癥組及腰椎間盤突出癥組中白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、環(huán)氧化酶2的陽(yáng)性表達(dá)率均高于腰椎外傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腰椎管狹窄癥組與腰椎間盤突出癥組中白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腰椎間盤突出癥組環(huán)氧化酶2 的陽(yáng)性表達(dá)率高于腰椎管狹窄癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 腰椎外傷組、腰椎管狹窄癥組、腰椎間盤突出癥組椎間盤組織病理表現(xiàn)

表1 三組IL-1β、IL-6 及COX-2 陽(yáng)性表達(dá)率比較（%）

3 討論

椎間盤是位于脊柱上下椎體之間的果凍樣彈性組織，由髓核、纖維環(huán)及上下軟骨終板構(gòu)成，其主要作用是在軸向上承受并緩沖向下傳導(dǎo)的力學(xué)負(fù)荷。椎間盤的退變是脊柱退行性變病程中首先發(fā)生的病理過(guò)程，部分研究表明椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞是導(dǎo)致椎間盤退變的首要原因[7]。椎間盤是一個(gè)無(wú)血管器官，髓核被纖維環(huán)和終板包繞，與機(jī)體免疫系統(tǒng)隔離，被認(rèn)為是機(jī)體的免疫赦免區(qū)。在正常狀態(tài)下，由于動(dòng)態(tài)壓力的作用，髓核通過(guò)軟骨終板內(nèi)的毛細(xì)血管與微孔與機(jī)體進(jìn)行代謝物質(zhì)交換，其內(nèi)部應(yīng)保持低氧、低pH、低細(xì)胞密度環(huán)境，維持椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)主要靠結(jié)構(gòu)的完整及代謝的平衡。隨著年齡增長(zhǎng)，髓核內(nèi)水分持續(xù)丟失，新合成的細(xì)胞基質(zhì)逐漸減少，導(dǎo)致椎間盤承受應(yīng)力的能力逐漸減弱，最終負(fù)荷超過(guò)承受極限而導(dǎo)致纖維環(huán)破裂、髓核突出，內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡被打破。破裂的椎間盤與機(jī)體免疫系統(tǒng)接觸，即會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生的炎性因子刺激椎間盤組織產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTs），加速基質(zhì)降解，進(jìn)一步促進(jìn)椎間盤退變過(guò)程[8]。研究表明，退變椎間盤組織中有大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，且多種炎性因子的表達(dá)增高，這些炎性因子可作用于周圍的脊髓、神經(jīng)根或脊神經(jīng)節(jié)發(fā)生炎性反應(yīng)[6]。

白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 和環(huán)氧化酶2 是重要的炎癥細(xì)胞因子，很多研究證實(shí)其與腰椎退行性變患者的臨床癥狀有密切關(guān)系，但目前無(wú)明確量化研究[9，10]。白細(xì)胞介素1β 是白細(xì)胞介素1 的一種亞型（其余兩種亞型為白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素1受體拮抗劑），作為關(guān)鍵促炎性炎性因子在椎間盤退變炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)與趨化作用中起到重要作用[11]。實(shí)驗(yàn)表明，在椎間盤細(xì)胞中加入白細(xì)胞介素1β 可破壞椎間盤基質(zhì)合成與分解代謝的平衡，促進(jìn)椎間盤基質(zhì)降解，進(jìn)而加速椎間盤退變，椎間盤纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙后滲漏的炎性因子可刺激纖維環(huán)內(nèi)的疼痛感受器，引起腰痛等臨床癥狀[12，13]。白細(xì)胞介素6 作為重要的炎癥遞質(zhì)也在腰椎間盤退變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，在發(fā)生退行性變的腰椎間盤組織中可檢測(cè)到白細(xì)胞介素6 的存在，且其分泌量與白細(xì)胞介素1β 的刺激呈正相關(guān)。白細(xì)胞介素6 作為“下游”炎癥因子，可刺激炎性細(xì)胞聚集激活及炎性遞質(zhì)的釋放，促進(jìn)椎間盤細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，加速椎間盤基質(zhì)降解，破壞椎間盤“穩(wěn)態(tài)”，改變其物理及生化特性，與白細(xì)胞介素1β 共同完成椎間盤退變的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11]。同時(shí)白細(xì)胞介素6 可通過(guò)具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，可誘發(fā)椎間盤的自身免疫反應(yīng)[14]。在本研究中，對(duì)椎間盤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后，腰椎管狹窄癥組腰椎間盤突出癥組中均可見大量白細(xì)胞介素1β 及白細(xì)胞介素6 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，且兩組間陽(yáng)性表達(dá)率基本一致，而腰椎外傷組表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞稀少，因此考慮白細(xì)胞介素1β與白細(xì)胞介素6 主要作用于腰椎退變過(guò)程。

新生血管形成在退變椎間盤的自發(fā)性吸收過(guò)程中起關(guān)鍵作用，環(huán)氧化酶2 作為前列腺類炎癥因子被花生四烯酸催化過(guò)程的限速酶，可通過(guò)調(diào)節(jié)前列腺類炎癥因子的表達(dá)誘導(dǎo)新生血管的形成，同時(shí)抑制椎間盤組織內(nèi)蛋白多糖的合成，在椎間盤退變過(guò)程中起重要作用[15]。同時(shí)，環(huán)氧化酶2 作為局部炎癥反應(yīng)的特異性因子，通過(guò)前列腺素E2 等炎癥因子的表達(dá)，可增強(qiáng)神經(jīng)末梢感受器的敏感性,降低組織痛閾值，使其處于痛敏狀態(tài)，從而增強(qiáng)并延長(zhǎng)5-羥色胺、組胺等炎性因子的致痛作用[16]。環(huán)氧化酶2 在正常椎間盤中幾乎不表達(dá)，而在退變椎間盤內(nèi)可陽(yáng)性表達(dá)[12]。在本研究中，腰椎間盤突出癥組椎間盤組織中可見大量環(huán)氧化酶2 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，且在纖維環(huán)破裂髓核脫出的標(biāo)本中尤為顯著，腰椎管狹窄癥組中相對(duì)較少，腰椎間盤突出癥組中環(huán)氧化酶2表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞稀少，考慮環(huán)氧化酶2 參與腰椎間盤退變的過(guò)程，但其高表達(dá)的主要刺激因素為局部炎癥反應(yīng)。

綜上所述，發(fā)生退行性變的腰椎間盤組織中存在白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 和環(huán)氧化酶2 細(xì)胞因子表達(dá)，并在腰椎間盤早期退變中發(fā)揮作用；另外，不同類型的腰脊髓神經(jīng)壓迫患者白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 和環(huán)氧化酶2 的表達(dá)存在一定差異。