GC法測(cè)定留蘭香根莖葉中香芹酮的含量

羅洪蓮 萬(wàn)紅才 劉曉艷 徐作剛 段 萍 任永奇

黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 都勻 558000

留蘭香(MenthaspicataL.)為唇形科薄荷屬(Mentha Linn)植物，又名狗肉香，在我國(guó)貴州、云南、四川、新疆等地均有栽培，其味辛、甘，性微溫，具有疏風(fēng)解表、理氣止痛、之功效。現(xiàn)代藥理研究表明：留蘭香具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗氧化活性[1-4]，常用于治療感冒發(fā)熱、咳嗽、頭痛、咽痛、跌打瘀痛、胃腸脹氣、烏疔、雞窩寒、全身麻木和小兒瘡癤。留蘭香味清新、涼爽、香甜，其嫩葉常做調(diào)味香料食用，其揮發(fā)油廣泛應(yīng)用于牙膏、口香糖、糖果、香皂等物品的加香[5]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道香芹酮為留蘭香揮發(fā)油的主要有效成分[6]，但其在全草中的含量分布情況尚不明確，為提高留蘭香資源的利用效率，本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜法(GC)及薄層色譜法對(duì)其根、莖、葉中的香芹酮含量差異進(jìn)行比較。

1 儀器與試藥

Aglient 7890B 氣相色譜儀(美國(guó)Aglient公司)，SK250LHC超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)儀器有限公司)，AG135電子天平(梅特勒托利多)；香芹酮對(duì)照品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 批號(hào): 141713,含量：99.0%)，正十一烷對(duì)照品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH批號(hào)：G169369，含量99.6%)，其他試劑均為化學(xué)分析純。10批次留蘭香藥材分別采集于都勻大坪(批號(hào)：201901)、都勻邦水(批號(hào)：201902)、開(kāi)陽(yáng)毛云(批號(hào)：201903)、獨(dú)山麻萬(wàn)(批號(hào)：201904)、獨(dú)山影山(批號(hào)：201905)、遵義桐梓(批號(hào)：201906)、都勻劍江河(批號(hào)：201907)、都勻洛邦(批號(hào)：201908)、威寧草海(批號(hào)：201909)、畢節(jié)清水(批號(hào)：201910)，均經(jīng)貴州省食品藥品檢驗(yàn)所李揚(yáng)主任藥師鑒定為留蘭香藥材。

2 方法與結(jié)果

2.1 留蘭香根莖葉的薄層圖譜 分別稱(chēng)取3批次留蘭香藥材(批號(hào)分別為：201901、201902、201903)根、莖、葉細(xì)粉3.0 g,加乙醇30 mL，水浴回流30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液2 mL作為供試品溶液。另取香芹酮對(duì)照品約10mg，置10ml量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷：乙酸乙酯：甲酸(10∶1∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。3個(gè)批次的留蘭香葉供試品溶液色譜中，在與香芹酮對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，在莖與根的供試品溶液色譜中，幾乎看不見(jiàn)與香芹酮對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)。色譜圖如圖1所示。

1.香芹酮對(duì)照品；2～10依次為3個(gè)批次留蘭香藥材的葉、莖、根圖1 留蘭香根莖葉的薄層圖譜

2.2 留蘭香根莖葉中的香芹酮GC含量測(cè)定

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取正十一烷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用正己烷稀釋制成正十一烷濃度為0.2 mg/mL的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取香芹酮對(duì)照品適量，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋制成香芹酮濃度約為0.2 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取留蘭香粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入10 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加塞，超聲30 min，放冷至室溫，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.4 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)；檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器;程序升溫條件初始溫度50 ℃,以2 ℃ /min 升溫至 115 ℃,以 5 ℃ /min 升溫至 150 ℃ ;氣化室溫度 250 ℃ ;檢測(cè)室溫度 280 ℃;尾吹 20 mL;空氣 400 mL;氫氣 40 mL;進(jìn)樣量 1 μL。在上述試驗(yàn)條件下，樣品中的香芹酮、內(nèi)標(biāo)正十一烷與其他各雜質(zhì)峰的分離度達(dá)到要求且峰形良好，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版 四部通則0513氣相色譜法項(xiàng)下的規(guī)定。

圖3 香芹酮對(duì)照品溶液氣相色譜圖

圖4 留蘭香葉供試品溶液氣相色譜圖

2.2.5 線性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取32 mg香芹酮對(duì)照品置10 mL量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液溶解并稀釋制成3.2 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品貯備液，精密量取對(duì)照品貯備液適量，用內(nèi)標(biāo)溶液逐級(jí)稀釋制成濃度分別為1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密吸取1μL按2.2.4色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以香芹酮對(duì)照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，以香芹酮對(duì)照品質(zhì)量濃度 C(mg/mL) 為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到香芹酮的回歸方程:Y=0.848X-0.0119(R=0.9998)，即香芹酮質(zhì)量濃度在 0.05 ～ 3.2 mg/mL間呈良好的線性關(guān)系。見(jiàn)表1、圖5。

表1 香芹酮線性關(guān)系數(shù)據(jù)表

圖5 香芹酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，考察系統(tǒng)的精密度。香芹酮峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比的RSD為0.04%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版四部通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中對(duì)精密度的要求(RSD≤2%)。見(jiàn)表2。

表2 香芹酮精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、6、8、10 h精密吸取供試品溶液1μL按2.2.4色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。香芹酮峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比的RSD為0、06%，表明此條件下香芹酮在10 h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表3。

表3 香芹酮穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 平行取批號(hào)為201902的留蘭香藥材葉粉末樣品6份，按上述方法制備供試品溶液及對(duì)照品溶液，按2.2.4色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，6份樣品中香芹酮百分含量之間的RSD為1.88%。見(jiàn)表4。

表4 香芹酮重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取香芹酮對(duì)照品25 mg，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋制成2.5 mg/mL的對(duì)照品貯備液。分別精密吸取對(duì)照品貯備液1 mL、2 mL、3 mL置50 mL量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋制成香芹酮濃度分別為0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL的溶液，分別作a、b、c溶液。取9份已知香芹酮含量的留蘭香葉粉末(香芹酮含量為0.384%，見(jiàn)表4)約0.25g，精密稱(chēng)定，分別置9個(gè)具塞錐形瓶中，每三份分別精密加入a、b、c溶液10 mL，加塞，超聲30 min，放冷至室溫，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，分別精密吸取1μL按2.2.4色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)的回收率。平均回收率為96.5%，RSD%為1.3%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版四部通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中對(duì)回收率的要求。見(jiàn)表5。

表5 香芹酮回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 留蘭香根莖葉中香芹酮含量的測(cè)定結(jié)果 取10個(gè)不同批次留蘭香樣品，按上述方法制備供試品溶液及對(duì)照品溶液，各精密吸取1μL按2.4色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 5批樣品中香芹酮含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)首先選用合適的薄層色譜法[7]，對(duì)不同批次留蘭香根、莖、葉中的香芹酮含量進(jìn)行測(cè)定，由圖1可見(jiàn)，3個(gè)批次的留蘭香葉供試品溶液色譜中，在與香芹酮對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同斑點(diǎn)，在莖與根的供試品溶液色譜中，幾乎看不見(jiàn)與香芹酮對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，表明留蘭香葉中香芹酮的含量較高，能在薄層圖譜中顯清晰斑點(diǎn)，而莖根中香芹酮的含量很低以致此薄層色譜方法未能鑒別出。為進(jìn)一步確定根莖葉中香芹酮的含量，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，本試驗(yàn)選用上述氣相色譜條件[8]，建立留蘭香藥材中香芹酮的GC含量測(cè)定方法，并對(duì)此方法進(jìn)行方法學(xué)考察，確定該方法準(zhǔn)確、可靠。測(cè)定結(jié)果表明，留蘭香藥材不同部位中的香芹酮含量差異顯著，含量高低為：葉>莖>根。此次研究明確了留蘭香藥材中香芹酮的主要分布部位，為其藥用部位的選擇提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)，以提高留蘭香資源的利用效率。