金雞毛草提取物經(jīng)Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍愈合的作用研究*

于澤洋 李天博 王江寧

（首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院，北京 100038）

壓瘡即壓力性潰瘍，是由于壓力或結合剪切力而導致的通常在骨突出處對皮膚和/或下面的組織的局部損傷［1］。壓瘡通常具有較大的損傷范圍，容易引起敗血癥、全身衰竭和其他危及生命的并發(fā)癥［2-3］。在昏迷、四肢癱瘓、衰老和虛弱、外傷性固定和嚴重營養(yǎng)不良等長期臥床患者中，壓瘡是一種常見的并發(fā)癥［4］。Ⅲ期壓瘡構成嚴重感染和截肢的重大風險，因此尋求新的Ⅲ期壓瘡潰瘍治療方法意義重大。金雞毛草具有舒筋接骨、涼血止血、消炎止痛、祛風消腫、降血糖的功效，常用于治療咳嗽氣喘、血瘀腫痛、目赤腫痛、崩漏外傷出血、支氣管肺炎、小兒高熱、百日咳、風濕關節(jié)痛、跌打損傷、骨折、乳腺炎、瘡瘍疔腫、燒燙傷、糖尿病等癥［5］。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）途徑是調(diào)節(jié)傷口愈合的主要過程之一，可改善傷口的血管生成和上皮重塑［6-7］。大量的實驗研究表明Wnt/β-catenin信號通路參與了許多生物學過程等，包括細胞增殖、凋亡、分化以及干細胞多能性的維持［8］。本研究探討金雞毛草提取物經(jīng)Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍愈合的作用，為Ⅲ期壓瘡潰瘍的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠購自四川大學實驗動物中心，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-0002，動物使用許可證號：SYXK（川）2018-0014，動物質(zhì)量合格證號：SC2020031427，大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～26℃，光照（12 h∶12 h光照-黑暗循環(huán)），濕度60%～70%。

1.2 試藥與儀器

金雞毛草提取物（原料藥，純度99%，甘肅益生祥生物技術有限公司，批號TR3067；用生理鹽水配制成質(zhì)量濃度0.4、0.8、1.6 g/mL的溶液備用）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海碧云天生物技術研究所，批號C0105L、PI517、PI603、P5349-10）；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號MT0010、DT0034）；Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號DRR330）；放射免疫沉淀測定裂解緩沖液、BCA蛋白測定試劑盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Thermo Fisher公司，批號KK436532、DM30447、WE9153）；羊抗鼠 Wnt、β-catenin、GAPDH一抗（愛必信上海生物科技有限公司，批號TA502075、TA501107、TA0013）；羊抗鼠二抗（武漢晟亞生物技術有限公司，批號KPL-1255L）；SZX10-1111型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；MA-6000型實時熒光定量PCR儀（蘇州雅睿生物技術有限公司）；ChemiDoc XRS凝膠成像分析系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

1.3 模型制備

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗，將大鼠右側(cè)臀部備皮，于臀部切開長約2 cm皮膚，手術鑷鈍性分離臀大肌，然后將磁片（直徑15 mm、厚2 mm）植入到臀大肌內(nèi)，縫合皮膚，消毒。24 h后，將另一磁鐵放置于植入磁片的皮膚處，兩塊磁鐵互相吸引產(chǎn)生磁鐵引力造成局部缺血，2 h后取下外源磁鐵，間隔30 min重復以上步驟，每日4次。Ⅲ期壓瘡潰瘍成模標準：4 d后，當受壓皮膚變黑、變硬，用針刺不出血［9］。成功造模48只大鼠。

1.4 分組與給藥

將造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組與金雞毛草提取物低、中、高劑量組，每組12只。另取12只正常大鼠作為對照組。金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠分別給予4、8、16 g/kg的金雞毛草提取物灌胃［10］，灌胃體積 10 mL/kg，對照組和模型組灌胃生理鹽水10 mL/kg，每天1次，給藥2周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 創(chuàng)面愈合率的測定 分別于造模完成后和給藥結束后對潰瘍進行照相，并通過ImageJ軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）測量潰瘍面積，潰瘍愈合率=（造模完成后潰瘍面積-給藥結束后潰瘍面積）/造模完成后潰瘍面積×100%。

1.5.2 血清炎癥因子水平檢測 給藥周期結束后，對大鼠進行腹膜內(nèi)麻醉，并從腹主動脈中提取全血樣品，將樣品在室溫下放置1.5～2 h，然后以1 500×g離心20 min，分離血清，采用ELISA試劑盒檢測血清IL-2、IL-4、TNF-α水平。

1.5.3 壓瘡潰瘍組織病理觀察 給藥周期結束后，分離模型組、金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠壓瘡潰瘍組織和對照組大鼠相同部位正常組織，常規(guī)HE染色，顯微鏡觀察大鼠壓瘡潰瘍組織和正常組織病理改變情況。

1.5.4 壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin mRNA水平測定 收集模型組、金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠壓瘡潰瘍組織和對照組大鼠相同部位正常組織，使用TRIzol試劑提取組織中總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒在實時熒光定量PCR儀中進行反應。引物由上海麥特英杰生物科技有限公司設計和合成，引物序列如下：Wnt正向：5′-TGCTCATCACTTGCTAGTCGACTA-3′，Wnt反向：5′-TGTCGTAGCTAGTCGCGCTCCCGT-3′；β -catenin 正向：5′-TGTCGTAGCCTAGTGCTGTTGTGCGTA-3′，βcatenin反向：5′-GTGCGGGTCAACGTGTACGCTCTGTGT-3′；β-actin正向：5′-TTGTGACGTGACGCGAGATGTGCGT-3′，β-actin 反向：5′-CTGTGCGTGACGTACAGGTTGTGCG-3′。PCR反應體系如下：Premix Ex Taq TM 2 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、cDNA 3 μL、dH2O 4 μL。反應條件為：95℃ 15 s，61 ℃ 15s和72 ℃ 20 s，30 個循環(huán)。使用 2-ΔΔCt方法分析 Wnt、βcatenin mRNA表達水平。

1.5.5 壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin蛋白水平測定 收集模型組、金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠壓瘡潰瘍組織和對照組大鼠相同部位正常組織，用放射免疫沉淀測定裂解緩沖液提取組織中總蛋白，采用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，然后將蛋白裂解物進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，將膜與稀釋比均為1∶1 500的 Wnt、β-catenin、GAPDH 一抗常溫孵育過夜，將膜用TBST緩沖液洗滌，然后與二抗（1∶5 000）孵育2 h，收集蛋白帶圖像，并用凝膠成像分析系統(tǒng)分析相對光密度。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。實驗結果以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較

見表1。與模型組比較，金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率升高（P＜0.05）；隨著金雞毛草提取物給藥劑量的增加，金雞毛草提取物各劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率逐漸升高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較（%，±s）

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；金雞毛草提取物低劑量組比較，△P＜0.05；與金雞毛草提取物中劑量組比較，▲P＜0.05。下同。

組別對照組模型組金雞毛草提取物低劑量組金雞毛草提取物中劑量組金雞毛草提取物高劑量組n 12 12 12 12 12創(chuàng)面愈合率-12.85±2.51 24.36±2.35#39.56±2.54#△50.59±2.34#△▲

2.2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

見表2。與對照組比較，模型組大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α水平降低（P＜0.05）；隨著金雞毛草提取物給藥劑量的增加，金雞毛草提取物各劑量組大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α水平逐漸降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（mmol/L，±s）

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（mmol/L，±s）

組別對照組模型組金雞毛草提取物低劑量組金雞毛草提取物中劑量組金雞毛草提取物高劑量組n 12 12 12 12 12 IL-2 156.63±23.65 496.65±26.58*374.31±24.85*#298.47±22.87*#△229.85±26.87*#△▲IL-4 136.96±19.65 485.63±18.47*362.42±19.54*#274.27±16.69*#△200.52±17.98*#△▲TNF-α 147.96±16.96 354.25±15.94*299.83±17.85*#257.71±14.66*#△205.56±16.54*#△▲

2.3 各組大鼠壓瘡潰瘍組織形態(tài)學比較

對照組大鼠皮膚組織結構正常，可見大量成纖維細胞及毛細血管；模型組大鼠壓瘡潰瘍組織大量炎癥細胞浸潤，成纖維細胞及毛細血管數(shù)目明顯減少，表皮明顯變薄；金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠壓瘡潰瘍創(chuàng)面組織已經(jīng)出現(xiàn)結痂，且表皮明顯增厚，炎性細胞浸潤較輕。見圖1。

圖1 各組大鼠壓瘡潰瘍組織形態(tài)學病理圖（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin mRNA水平比較

見表3。與對照組比較，模型組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin mRNA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin mRNA水平降低（P＜0.05）；隨著金雞毛草提取物給藥劑量的增加，金雞毛草提取物各劑量組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin mRNA水平逐漸降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表3 各組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin mRNA水平比較（±s）

表3 各組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin mRNA水平比較（±s）

組別對照組模型組金雞毛草提取物低劑量組金雞毛草提取物中劑量組金雞毛草提取物高劑量組n 12 12 12 12 12 Wnt mRNA 1.52±0.34 4.36±0.35*3.79±0.39*#3.02±0.37*#△2.45±0.35*#△▲β-catenin mRNA 1.17±0.15 4.08±0.14*3.41±0.18*#2.97±0.17*#△2.34±0.16*#△▲

2.5 各組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin蛋白水平比較

見表4，圖2。與對照組比較，模型組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin蛋白水平降低（P＜0.05）；隨著金雞毛草提取物給藥劑量的增加，金雞毛草提取物各劑量組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin蛋白水平逐漸降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表4 各組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin蛋白水平比較（±s）

組別對照組模型組金雞毛草提取物低劑量組金雞毛草提取物中劑量組金雞毛草提取物高劑量組n 12 12 12 12 12 Wnt蛋白0.18±0.03 1.12±0.13*0.81±0.10*#0.60±0.09*#△0.41±0.07*#△▲β-catenin蛋白0.20±0.04 1.08±0.14*0.87±0.12*#0.61±0.08*#△0.43±0.06*#△▲

圖2 各組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin蛋白表達

3 討 論

壓瘡動物模型可分為缺血性壓瘡，缺血性再灌注壓瘡和細菌感染的壓瘡模型。缺血性壓瘡模型表現(xiàn)出諸如血液濃縮等病理變化，其特征在于血液黏度和血栓形成增加，這可能導致局部血液循環(huán)障礙、水腫和組織壞死［11-12］。缺血再灌注壓瘡是在身體受壓時引起的，并且毛細血管被阻塞，組織缺血缺氧將引起機體的補償反應。由于鈣超載，氧自由基的爆發(fā)以及炎癥因子的增加，在恢復血流時進一步加重了組織和器官的損害。目前，普遍觀察到壓瘡的原因是缺血再灌注引起的慢性皮膚和肌肉組織損傷。當前，通常使用磁壓縮、內(nèi)彈簧壓縮和機械壓縮方法來生成壓瘡模型。本研究采用磁性壓縮法來制備大鼠皮膚和肌肉組織的缺血-再灌注壓瘡模型。建模后4 d，我們觀察到皮膚變黑、變硬，且組織病理學鑒定證實了我們的觀察為Ⅲ期壓瘡，表明本研究成功產(chǎn)生了大鼠Ⅲ期壓瘡模型。

金雞毛草作為一種傷科中藥，有其獨特、卓著的療效，為醫(yī)家所習用。其含有多種活性成分，藥理作用多面［13］。金雞毛草不但可以單獨應用，也可和其他中、西藥配合應用，既能內(nèi)服和外敷，又能灌腸和噴藥，還可擦浴，具有止血愈傷、活血化瘀消炎消腫、排膿去毒的功效，對糖尿病足有肯定的療效［14］。本研究結果顯示：金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率高于模型組，血清IL-2、IL-4、TNF-α低于模型組，且呈劑量依賴性。這說明，金雞毛草提取物能加速大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍愈合，減輕大鼠Ⅲ期壓瘡炎癥反應。病理學結果中，金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍創(chuàng)面組織已經(jīng)出現(xiàn)結痂，且表皮明顯增厚，炎性細胞浸潤較輕，這也和上述結論相符。

本研究同時發(fā)現(xiàn)：金雞毛草提取物低、中、高劑量組大鼠壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平低于模型組，且呈劑量依賴性。這說明，金雞毛草提取物可促進大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍組織中Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平的表達進而激活Wnt/β-catenin信號通路。Ⅲ期壓瘡潰瘍愈合有4個重疊的過程，包括止血、炎癥反應、潰瘍表面增加和潰瘍表面重塑。治療Ⅲ期壓瘡潰瘍的主要挑戰(zhàn)包括潰瘍中缺少新血管，潰瘍的持續(xù)感染，以及皮膚真皮細胞的新血管形成或分化差。研究證實Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導的上調(diào)增加皮膚真皮細胞的活性。Wnt/β-catenin途徑會影響Ⅲ期壓瘡潰瘍愈合期間皮膚的厚度和色素沉著［15］。當皮膚處于Ⅲ期壓瘡潰瘍時，Wnt/β-catenin途徑的效應子參與了血管內(nèi)皮細胞的表達。Wnt/β-catenin途徑的下調(diào)是Ⅲ期壓瘡潰瘍不可預測的原因之一，可能是由于Ⅲ期壓瘡潰瘍產(chǎn)生的炎癥應激反應導致R-脊椎蛋白（Rspo）3減少［15］。Rspo蛋白家族由4個成員（Rspo1-4）組成，與Wnt信號通路密切相關。已經(jīng)證明Rspo蛋白可以激活Wnt信號傳導途徑，并且一些研究表明Rspo蛋白是誘導經(jīng)典的Wnt信號傳導途徑的一類新的信號傳導配體［16-18］。在糖尿病潰瘍的愈合研究中也發(fā)現(xiàn)，當增加Wnt和β-catenin時，表皮細胞的增殖、分化和遷移會增強，潰瘍愈合會加快。皮膚角質(zhì)形成細胞中的Wnt信號通路會影響創(chuàng)傷后皮膚的厚度和色素沉著，高水平的Wnt可以防止因高葡萄糖水平引起的血管內(nèi)皮細胞損傷。β-catenin的異常調(diào)節(jié)可以促進或抑制凋亡，而Wnt/β-catenin信號的上調(diào)可以增加高葡萄糖抑制的系膜細胞的活性［19-20］。這些研究結果與本研究結果一致。

綜上所述，金雞毛草提取物能加速大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍愈合，減輕大鼠Ⅲ期壓瘡炎癥反應；其機制可能與金雞毛草提取物可促進大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍組織Wnt、β-catenin mRNA和蛋白的表達進而激活Wnt/βcatenin信號通路有關。