巴氏新小綏螨毒死蜱抗性選育及生物學特性

王 莉, 程明明, 傅云梅, 方云洪, 魏志堂, 成祿艷, 雷 雙,丁莉莉, 于士將, 叢 林, 冉 春

(西南大學柑桔研究所, 重慶 400712)

巴氏新小綏螨Neoseiulusbarkeri隸屬于蛛形綱(Arachnida)蜱螨亞綱(Acari)寄螨總目(Paratiformes)中氣門目(Mesostigmata)植綏螨科(Phytoseiidae)。巴氏新小綏螨分布較為廣泛，在亞洲、美洲、澳洲和歐洲等均有發現(Momen, 1995; Moraesetal., 2004)，在我國主要分布在江西、湖南、廣東、福建、云南、河北等地(吳偉南等, 2009)。該螨常棲息于柑橘、番木瓜、黃花蒿等植物上和貯藏品中，捕食葉螨、癭螨、薊馬、粉虱和植物線蟲等小型有害生物(Nomikouetal., 2001; Messelinketal., 2006; Yangetal., 2020)。巴氏新小綏螨因其發育歷期短、產卵量高、擴散能力強、自然死亡率低等優點，被認為是良好的生物防治天敵之一(Bonde, 1989)，也是目前中國推廣應用面積最大的捕食螨之一(徐學農等, 2013a)。

雖然巴氏新小綏螨被廣泛應用于柑橘多種害螨的防治，但作為常綠果樹，柑橘有害生物種類較多，發生時間不同，因此，化學防治仍然是生產上最主要的防控措施。盡管化學農藥可快速降低蟲(螨)口基數，但其負面作用也不容忽視。尤其是有機磷和菊酯等廣譜性殺蟲劑對捕食螨等天敵毒性作用極大，嚴重影響其種群數量，顯著降低控害效果(Bostanian and Akalach, 2006; Van Leeuwenetal., 2010; 徐學農等, 2013b)。為更好地發揮生物防治效果，目前，世界各國先后開展了針對廣譜性殺蟲劑的捕食螨抗性品系選育工作，從而協調化學防治與生物防治的矛盾(黃明度等, 1987; Satoetal., 2001; Augeretal., 2005)。

毒死蜱具有廣譜、高效等優點，被廣泛運用于蔬菜、果樹等經濟作物上多種害蟲的防治，但該藥劑也顯示出對多種捕食性天敵的毒害作用(Limaetal., 2013; Pozzebonetal., 2015)。為解決該問題，許多學者篩選出了多種捕食螨毒死蜱抗性品系(Bonafosetal., 2007; Tirelloetal., 2012; Zhaoetal., 2013)，但在巴氏新小綏螨中尚未見報道。鑒于此，本研究在篩選獲得巴氏新小綏螨毒死蜱抗性品系的基礎上，組建實驗種群生命表比較了敏感品系和抗性品系在不同溫度條件下的適合度差異，進一步測定其捕食功能反應，旨在評估抗性產生對巴氏新小綏螨生物學特性的影響，為抗藥性巴氏新小綏螨室內飼養和田間應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試生物材料、藥劑和主要儀器

1.1.1供試螨源：巴氏新小綏螨敏感品系(S)以取食麥麩的橢圓食粉螨Aleuroglyphusovatus為獵物，于2010年飼養至今，期間未接觸任何藥劑，用作相對敏感品系。柑橘全爪螨Panonychuscitri自2008年在溫度25±1℃，相對濕度75%±5%，光周期14L∶10D條件下未接觸藥劑飼養(冉春等, 2013)至今，用作敏感品系。

1.1.2柑橘葉片：采自室內播種栽培未噴施過藥劑的尤力克檸檬(Eureka lemon)葉片。

1.1.3藥劑及主要儀器：48%毒死蜱(chlorpyrifos)乳油，購自美國陶氏益農公司(生產日期及批號：2016042602)；高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3781L-PC)，購自日本松下健康醫療器械株式會社；體視顯微鏡(ZSA0745)，購自重慶市奧特光學儀器公司；人工智能培養箱(I-30BLL)，購自美國Percival公司；Potter噴霧塔(Burkard)，購自英國Burkard Scientific公司。

1.2 室內毒力測定

參見楊娟生等(2020)的毒力測定方法，在巴氏新小綏螨雌成螨死亡率20%～80%范圍內將毒死蜱稀釋為5個濃度梯度(240, 120, 60, 30和15 mg/L)，用Potter噴霧塔，在2 MPa的壓力下將1 mL供試藥劑均勻噴灑于六孔凹槽(凹槽直徑×深度=15 mm×2.2 mm)有機玻璃板(長×寬×高=78 mm×58 mm×5 mm)，使其形成一層均勻的藥膜。同時，將蓋玻片浸泡于對應藥劑30 s后取出，與玻璃板一同放入通風櫥自然晾干。在每個凹槽中接入20～30頭橢圓食粉螨幼螨和若螨，再接入5頭2～3日齡巴氏新小綏螨雌成螨，蓋上蓋玻片，隨后用濕毛筆在蓋玻片周圍涂上清水，以防止試螨逃逸。將其置于人工培養箱中飼養，24 h后在體視顯微鏡下檢查巴氏新小綏螨雌成螨死亡數。用毛筆輕觸螨體，爬行距離不足一個螨體長者視為死亡。以清水作為對照，且對照組死亡率在10%以下視為有效測定，計算其死亡率和校正死亡率。每個處理90頭，重復4次。

1.3 室內抗性選育方法

參見Cong等(2016)捕食螨抗性篩選方法。在實驗室內采用麥麩-橢圓食粉螨-捕食螨體系大規模飼養繁殖。在1 L麥麩中噴灑150 mL的毒死蜱，用藥劑處理后的麥麩飼喂橢圓食粉螨，待其粉螨種群增長后，用更高劑量重復選擇。用Potter噴霧塔，將1 mL濃度為LC50的毒死蜱藥劑噴到巴氏新小綏螨敏感品系雌成螨上，24 h后將存活的雌成螨轉移到經藥劑篩選后的粉螨中，當巴氏新小綏螨種群數量增加到轉移數量的8～10倍時，再次進行毒力測定，并根據測定結果重新設定LC50劑量作為選擇壓力，重復篩選。

1.4 不同溫度條件下實驗種群生命表的組建

分別挑取足量處于產卵期的巴氏新小綏螨敏感品系和抗性品系雌成螨于六孔凹槽玻璃板中，2 h后，隨機挑取單個卵于另一新六孔凹槽玻璃板中進行單頭飼養，分別放置于不同溫度環境下(15, 20, 25, 30和35℃)。每個處理20～25粒卵，重復3次。每12 h觀察一次，待巴氏新小綏螨卵孵化后，每日定時定量向凹槽內補充橢圓食粉螨；當其進一步蛻皮為雌成螨時，挑入同一品系雄成螨進行配對飼養，記錄雌成螨存活、發育、繁殖等情況，直至其自然死亡為止。同時，將其單日所產的卵挑出，單獨飼養至成螨，計算每雌所產子代的雌性比例。實驗種群生命表參數的計算參照Birch(1948)和Howe(1953)的方法。相對適合度(Rf)的計算參見陳朗杰等(2015)和Chen等(2017)的方法，Rf=R0(R)/R0(S)，式中R和S分別指抗性品系和敏感品系。

1.5 捕食功能反應的測定

參照McMurtry和Scriven(1964)的方法，在每個凹槽中分別放入直徑為0.7 cm的圓形柑橘葉片，隨后依次接入3, 6, 9, 12, 15和18頭柑橘全爪螨(卵或雌成螨)，再各放入1頭饑餓24 h的敏感或抗性品系的巴氏新小綏螨成螨，分別置于15, 20, 25, 30和35℃的人工氣候培養箱內24 h，觀察巴氏新小綏螨在不同溫度條件下的捕食情況。每個獵物密度為一個處理，每個凹槽為一個重復，每個處理重復10次。實驗數據用Holling Ⅱ型功能反應進行擬合(Holling, 1959)，計算公式:Na=aTN/(1+aThN)，式中：Na為被捕食獵物數量；a為瞬時攻擊率；T為試驗總時間；N為獵物密度，即初始接入獵物密度；Th為捕食者處理1頭獵物所用的時間。將公式取倒數變形1/Na=1/aTN+Th/T，用最小二乘法求得參數a和Th，用a/Th值來評價巴氏新小綏螨的捕食能力(吳坤君等, 2004)，本實驗中T=1 d。

1.6 數據分析

校正死亡率參考Abbott(1925)公式計算。應用Excel 2016軟件計算毒力回歸方程、半致死濃度LC50及其95%置信度等參數。利用SPSS 20.0軟件單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏新復極差法對不同溫度條件下抗性品系和敏感品系發育歷期、壽命和繁殖力等參數總體進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 巴氏新小綏螨毒死蜱抗性品系的選育

由表1可知，經21代篩選后，獲得抗性倍數為34.77倍的巴氏新小綏螨毒死蜱中抗品系，其LC50水平由44.41 mg/L提高至1 544.02 mg/L。

表1 巴氏新小綏螨對毒死蜱的抗性選育Table 1 Resistance selection of Neoseiulus barkeri against chlorpyrifos

2.2 巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系在不同溫度下的發育歷期比較

整體而言，巴氏新小綏螨發育歷期與抗性獲得無關，而與溫度呈負相關(表2)。在15～30℃條件下，兩個品系的巴氏新小綏螨各階段發育歷期隨溫度升高而縮短;在30℃條件下，二者世代歷期均最短，分別為6.62±0.23和6.53±0.13 d；在35℃條件下，其發育歷期均有不同程度的延長;當溫度處于15℃時，敏感品系和抗性品系均不能產卵，不能完成整個世代歷期。

表2 巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系在不同溫度下的發育歷期Table 2 Developmental duration of the chlorpyrifos-susceptible and resistant strainsof Neoseiulus barkeri at different temperatures

2.3 巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系雌成螨在不同溫度條件下的年齡特征生命表

圖1表明，巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系雌成螨特定年齡存活率(lx)和生殖力(mx)均受溫度影響，且規律基本一致。即隨溫度升高，其存活率下降，平均壽命縮短，產卵期更集中，產卵高峰更明顯。在20, 25, 30和35℃時，敏感品系第一次產卵分別發生在第11, 7, 6和7天，每日單雌產卵量分別在第19, 14, 10和9天達到峰值, 分別為0.32, 1.61, 1.85和1.11粒。抗性品系第一次產卵分別發生在第12, 8, 6和7天，每日單雌產卵量分別在第17, 14, 9和11天達到峰值，分別為0.27, 1.58, 1.86和1.26粒。

圖1 不同溫度下巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系特定年齡存活率(lx)和特定年齡生殖力(mx)Fig. 1 Age-specific survival rate (lx) and age-specific fecundity (mx) of the chlorpyrifos-susceptible and resistant strainsof Neoseiulus barkeri at different temperatures

2.4 巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系在不同溫度條件下雌成螨的生殖生命表

巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系的生殖生命力除子代雌性比例外均受溫度影響(表3)。在15℃條件下，抗性品系的雌成螨壽命顯著短于敏感品系(P<0.05)。在25℃條件下，敏感品系和抗性品系的產卵期均最長，分別為24.82±1.50和21.34±1.26 d，敏感品系和抗性品系間有顯著性差異(P<0.05)。同時，該溫度條件下，敏感品系和抗性品系的單雌產卵量也最高，分別為41.64±1.04和38.80±0.93粒/雌，敏感品系和抗性品系間存在顯著性差異(P<0.05)。其次在30℃條件下時，敏感品系和抗性品系間的單雌產卵量也存在顯著性差異(P<0.05)，分別為32.89±0.74和30.90±0.74粒/雌。在實驗溫度范圍內，抗性品系的每日單雌產卵量和子代雌性比例與敏感品系相比無顯著差異(P>0.05)。

表3 毒死蜱抗性獲得對巴氏新小綏螨的壽命及繁殖特性的影響Table 3 Effects of the acquired chlorpyrifos resistance on the longevity and fecundity characteristics of Neoseiulus barkeri

2.5 巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系在不同溫度條件下的生命表參數和相對適合度

由表4可知，在20～35℃范圍內，抗性品系的內稟增長率(rm)、周限增長率(λ)、平均世代周期(T)及種群倍增時間(Dt)與敏感品系均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。抗性品系的凈增殖率(R0)僅在25℃條件下時顯著低于敏感品系(P<0.05)。此外，在25和30℃條件下，巴氏新小綏螨抗性品系的相對適合度略小于1，分別為0.930和0.964；而在20和35℃時抗性品系的相對適合度則略高于敏感品系。

表4 毒死蜱抗性獲得對巴氏新小綏螨生命表參數及相對適合度的影響Table 4 Effects of the acquired chlorpyrifos resistance on the life table parameters and relative fitness of Neoseiulus barkeri

2.6 巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系對柑橘全爪螨卵和雌成螨的捕食功能反應

由表5和6可知，巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系的捕食功能反應均受溫度影響。在15～30℃，巴氏新小綏螨敏感品系對柑橘全爪螨卵和雌成螨的瞬時攻擊率、捕食能力、最大日捕食量均隨溫度的升高而增大，處理時間則隨溫度升高而縮短。在30℃時，巴氏新小綏螨敏感品系對柑橘全爪螨卵和雌成螨的瞬時攻擊率分別為0.86和0.72；最大日捕食量分別為156.25粒和23.10頭。抗性品系的結果與之相似，在30℃時，抗性品系對柑橘全爪螨卵和雌成螨的瞬時攻擊率分別為0.87和0.69；最大日捕食量分別為140.85粒和22.32頭。

表5 巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系對柑橘全爪螨卵的捕食功能反應Table 5 Predation functional response of the chlorpyrifos-susceptible and resistant strainsof Neoseiulus barkeri to Panonychus citri eggs

表6 巴氏新小綏螨毒死蜱敏感品系和抗性品系對柑橘全爪螨雌成螨的捕食功能反應Table 6 Predation functional response of the chlorpyrifos-susceptible and resistant strains of Neoseiulus barkerito adult females of Panonychus citri

3 討論

早在20世紀70年代，就有學者對捕食螨進行田間抗性監測。Croft等(1976)發現田間偽新小綏螨Neoseiulusfallacis種群對有機磷類殺蟲劑產生抗性，該螨對谷硫磷和二嗪磷的抗性倍數水平分別達到75和120倍。Duso等(1992)報道了從果園收集的安德森鈍綏螨Amblyseiusandersoni種群對對硫磷、谷硫磷和西維因抗性水平較高。Bonafos等(2007)也發現葡萄園里的兩種捕食螨梨盲走螨Typhlodromuspyri和安德森鈍綏螨對毒死蜱、溴氰菊酯和高效氯氟氰菊酯均產生了中等至高水平的抗性。Tirello等(2012)報道從果園收集的Kampimodromusaberrans種群對毒死蜱產生了高水平抗性。在對中國南方地區田間的長毛新小綏螨N.longispinosus進行抗性監測時發現，該螨對毒死蜱、甲氰菊酯和阿維菌素的抗性倍數分別為379.98, 865.00和31.60倍(Zhaoetal., 2013)。這說明田間捕食螨種群對不同種類殺蟲劑易產生高水平抗性，是獲得捕食螨抗性品系的重要途徑。

除從長期施藥的農作物生態系統中采集抗性捕食螨外，室內用藥劑持續篩選是獲得抗藥性品系捕食螨的另一種途徑。其中，針對有機磷類殺蟲劑進行抗性選育的報道較多，例如：黃明度等(1987)在室內經過33次抗性篩選，選育出抗性倍數為18.9倍的尼氏真綏螨A.nicholsi抗亞胺硫磷品系；柯勵生等(1990)利用樂果對擬長毛新小綏螨N.pseudolongispinosus篩選后，其抗性較原來提高了10.02倍；Sato等(2001)則在室內選育出了奧氏新小綏螨N.womersleyi抗殺撲磷品系，通過葉碟法和玻璃管藥膜法測定其抗性倍數分別為181和303倍。本研究通過室內毒死蜱21代持續篩選，獲得了抗性倍數為34.77倍的巴氏新小綏螨中抗品系(表1)，該品系對毒死蜱的抗性水平呈緩慢上升趨勢，若需田間推廣巴氏新小綏螨抗性品系，還需毒死蜱進一步篩選，獲得抗性倍數更高的新品系，進而達到更好的防治效果。

抗性的產生往往會導致昆蟲(螨)生物學特性變化。一般來說，昆蟲(螨)抗藥性的上升，會導致其適合度下降，即抗性個體常表現出發育歷期延長、存活率和生殖力降低等現象，從而抑制其抗性的發展(Miyo and Oguma, 2002; Kliot and Ghanim, 2012)。例如，二斑葉螨Tetranychusurticae抗密滅汀品系與敏感品系相比，各螨態發育歷期有所延長，后代雄性比例升高，繁殖力和相對適合度均有所下降，相對適合度下降為0.637，表現出適合度缺陷(Nicastroetal., 2011)。同樣，付步禮等(2017)研究發現，對乙基多殺菌素產生中等抗性的黃胸薊馬Thripshawaiiensis種群，其成螨壽命顯著縮短，各螨態發育歷期顯著延長，繁殖力顯著下降，種群增長受到抑制，存在適合度代價(Rf=0.886)。但對于天敵而言，若抗性產生后對其產卵量和壽命等生物學特性無顯著影響，或產生積極影響更將有利于該天敵在害蟲綜合治理(integrated pest management, IPM)中發揮積極作用(Fournieretal., 1988; Fitzgerald and Solomon, 2000)。如Fournier等(1988)發現，對殺撲磷產生抗性的智利小植綏螨Phytoseiuluspersimilis的適合度就沒有發生顯著變化。同樣，劉雨芳和Miyata(2007)研究發現，在獲得殺撲磷抗性后，奧氏新小綏螨的各發育歷期、產卵期、每雌日產卵量、總產卵量、卵孵化率及雌雄成螨性比等，在殺撲磷抗性品系與敏感品系之間無顯著差異。另有研究發現，抗阿維菌素的胡瓜新小綏螨N.cucumeris品系則表現出適合度優勢(Rf=1.14)，雖然抗性獲得導致其發育歷期和壽命明顯縮短，但其平均產卵量卻顯著高于敏感品系，此外，抗性品系的凈繁殖率(R0)、內稟增長率(rm)和周限增長率(λ)也略高于敏感品系(Chenetal., 2017)。在昆蟲中也觀察到類似的現象。如對擬除蟲菊酯和有機磷藥劑產生抗性的天敵昆蟲綠草蛉Chrysoperlacarnae也表現出適合度優勢，其內稟增長率(rm)、產卵量及種群倍增時間(Dt)等均顯著高于敏感品系(Pathanetal., 2010)。Mansoor等(2013)同樣報道了有關抗性綠草蛉適合度變化的情況，對阿維菌素苯甲酸鹽產生318倍的綠草蛉抗性品系也存在適合度優勢(Rf=1.49)，其成蟲的羽化率、繁殖力和卵孵化率均顯著提高。本實驗中，對抗性品系和敏感品系在不同溫度條件下的生命歷期及繁殖力等進行了詳細對比，發現巴氏新小綏螨毒死蜱抗性品系各螨態發育歷期、子代雌性比例、每日單雌產卵量、內稟增長率(rm)、周限增長率(λ)和平均世代周期(T)等參數較敏感品系無顯著差異(P>0.05)(表2和3)。在25和30℃條件下時，抗性品系的相對適合度較敏感品系略有下降，分別為0.930和0.964；而在20和35℃時，相對適合度較敏感品系略有上升，分別為1.049和1.004(表4)。整體而言，巴氏新小綏螨毒死蜱抗性的獲得沒有顯著影響其生長發育。

捕食性昆蟲(螨)抗性的獲得是否會影響其對獵物的捕食能力，目前相關的報道較少。周浩楠等(2020)報道了不同溫度條件下(16, 20, 24, 28和32℃)等鉗蠊螨Blattisociusdentriticus聯苯肼酯抗性品系對柑橘全爪螨卵和雌成螨的捕食功能反應。結果表明，抗性獲得后對其捕食量和捕食功能反應影響不大。同樣，巴氏新小綏螨在獲得甲氰菊酯抗性后，每頭總捕食量未發生顯著變化(侯棟元等, 2020)。而金劍雪等(2012)則報道了七星瓢蟲Coccinellaseptempunctata吡蟲啉抗性獲得后，不同蟲態的捕食量均有所下降，削弱了其對獵物豆蚜Aphiscraccivora的控制作用。但也有研究發現，對擬除蟲菊酯和有機磷藥劑產生抗性的綠草蛉，其捕食能力則顯著提高(Pathanetal., 2010)。本研究應用捕食功能反應系統比較了不同溫度下巴氏新小綏螨敏感品系和抗性品系對柑橘全爪螨卵和雌成螨的捕食量(表5和6)，研究結果與周浩楠等(2020)報道的結果相一致，巴氏新小綏螨毒死蜱抗性獲得后并未影響其對柑橘全爪螨(卵和雌成螨)的捕食能力。這說明巴氏新小綏螨毒死蜱抗性品系具有投入田間應用的潛力和價值。