黃芩素調節Rho-ROCK-MLC通路抑制乳腺癌細胞的生長與轉移

蔡菲菲，王秀峰，周錢梅，陸奕宇，蘇式兵

上海中醫藥大學交叉科學研究院中醫復雜系統研究中心，上海 201203

乳腺癌(breast cancer)在中醫學范疇被稱為“乳巖”、“乳石癰”等，是女性中最常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率不斷上升，發病年齡越來越小，嚴重威脅著女性的健康[1]。雖然乳腺癌在早期篩查、手術和放化療技術等方面有了顯著的進展，但對于晚期乳腺癌的全身性轉移，臨床缺少安全有效的治療藥物，是目前臨床治療的難點，也是乳腺癌患者死亡的主要原因之一。中藥及其活性成分被報道具有抑制乳腺癌轉移的作用[2]，成為乳腺癌轉移治療藥物的研究熱點之一。黃芩素(baicalein)是中藥黃芩的主要生物活性成分之一，在體內外研究中均已被證明具有抗腫瘤、抗炎、抗心血管疾病和抗菌活性[3]。近年來，黃芩素因能抑制腫瘤細胞的增殖，或誘導低毒性癌細胞的凋亡和自噬性細胞死亡[4]，尤其因其能抑制乳腺癌的轉移而受到越來越多的關注[5,6]。乳腺癌組織中異常激活的RhoA和ROCK，引起下游MLC磷酸化增強，導致細胞的遷移和侵襲[7]。本研究旨在通過建立人乳腺癌異種移植瘤裸鼠模型，觀察黃芩素抑制乳腺癌生長和轉移的體內作用，并探討黃芩素參與ROCK介導的細胞骨架重組抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的作用機制。

1 材料

1.1 動物

4～6周齡的BALB/c裸小鼠，雌性，體質量20±2 g，動物合格證編號：SCXK(滬)2012-0002，于上海中醫藥大學動物實驗中心SPF實驗室飼養。

1.2 藥物

黃芩素(含量98%)產品編號：05-2001，上海中藥標準化研究中心提供，用二甲基亞砜(DMSO)稀釋為100 mmol/L，0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝。紫杉醇注射液，批號090603，30 mg/5 mL，購自海口市制藥廠有限公司。

1.3 試劑

RPMI 1640培養基(美國GIBCO公司)；胎牛血清FBS(美國PAA公司)；胰蛋白酶(美國Amersco公司)；DMSO(美國Sigma公司)；SDS、Aprotinin、Tris-base(國藥集團化學試劑有限公司)；PMSF、APS、TEMED、蛋白定量試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)；抗體GAPDH等(美國Cell Signaling Technology公司)；Transwell小室(美國Corning-Costar公司)；Y-27632(美國MedChemExpress公司)。

1.4 儀器

生物安全柜(HFsafe-500，香港力康發展有限公司)；CO2細胞恒溫培養箱(3111，美國Thermo Forma公司)；倒置顯微鏡(100-120，日本Olympus公司)；酶聯免疫檢測儀(Synergy2，美國BioTek公司)；離心機(ST16R，美國Thermo Forma公司)；Bio-Rad電泳儀及轉印系統(1658033，美國Bio-Rad公司)；化學發光成像儀(Tanon 2500，上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 黃芩素安全性評價

將30只4～6周齡的SPF級BALB/c雌性裸小鼠隨機分為正常對照組、生理鹽水組、黃芩素組，每組10只。生理鹽水組、黃芩素組分別予0.2 mL生理鹽水和黃芩素組100 mg/kg腹腔注射給藥，每天一次，共給藥8周。每日稱量并記錄體重，8周后，摘眼球取血，頸脫位法處死，將血液離心分離血清和血細胞凍存于-80 ℃。檢測血清肝功指標ALT、AST和腎功能指標BUN、Cr以評價黃芩素的毒副作用。本研究根據上海中醫藥大學動物護理和使用委員會出版的《實驗動物護理和使用指南》中規定的動物護理標準進行，方案經上海中醫藥大學動物保護與利用委員會批準。

2.2 黃芩素對人乳腺癌異種移植瘤裸鼠的作用研究

20只SPF級BALB/c雌性裸小鼠，隨機分為正常組、模型組、紫杉醇組及黃芩素組，每組5只。除正常組外，將細胞總數為5×106的人乳腺癌細胞MDA-MB-231注射到裸鼠右上肢腋下乳房脂肪墊中，觀察并記錄裸鼠體重變化和腫瘤生長情況。在造模后的第二天開始給藥。黃芩素組以50 mg/kg[5]，隔天一次給藥0.2 mL；紫杉醇組以10 mg/kg[8]，每三天一次給藥0.2 mL；正常組、模型組以等量的生理鹽水0.2 mL腹腔注射給藥，每天一次，共給藥8周。給藥8周的裸鼠稱體重后，摘眼球取血，頸脫位法處死。血液離心分離血清和血細胞凍存于-80 ℃。完整剝離腫瘤組織，稱取腫瘤組織重量，一部分放入福爾馬林組織固定液中，另一部分-80℃凍存。用1 mL注射器從裸鼠主支氣管注入適量福爾馬林固定液后摘下整個肺臟，放入福爾馬林中固定，常規石蠟包埋，4 μm切片做H&E染色。

2.3 黃芩素抑制乳腺癌侵襲轉移作用機制研究

2.3.1 細胞分組及處理

用含10% FBS的1640培養基常規培養MDA-MB-231細胞至對數生長期，分為正常對照組，黃芩素組，抑制劑Y-27632組和黃芩素組與抑制劑聯用組。黃芩素組分別用100、50、25 μM的黃芩素進行干預，抑制劑組用10 μM Y-27632干預，聯用組以100 μM黃芩素+10 μM Y-27632干預細胞。

2.3.2 Transwell小室實驗評估細胞遷移力

將各組MDA-MB-231細胞預先接種在24孔Transwell小室上室中，下室加入含10% FBS的1640培養基，37 ℃，5% CO2培養24 h后，清洗并擦拭除去上室表面的非遷移細胞。將遷移的細胞用4%多聚甲醛固定，用0.1%結晶紫染色，并在顯微鏡下對每個腔室的至少三個視野進行計數。遷移抑制率=(1-實驗組遷移細胞數/對照組遷移細胞數)×100%。

2.3.3 免疫熒光染色觀察細胞骨架蛋白F-actin變化

各組MDA-MB-231細胞經用藥處理24 h后，用4%多聚甲醛固定，室溫下在濕盒中孵育稀釋好的一抗及二抗，用PBS清洗，干燥后封片，即刻在激光共聚焦顯微鏡檢查下觀察。

2.3.4 Western blot法檢測細胞蛋白表達

收集各組MDA-MB-231細胞并裂解，以BCA蛋白測定其蛋白濃度。用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白質，并轉移到PVDF膜上。在4 ℃下將膜與主要抗體一起孵育過夜，將GAPDH作為內參對照，在室溫下用二抗孵育1 h。最后，使用化學發光成像儀可視化目標蛋白條帶

2.4 統計學方法

使用SPSS 25.0和Graphpad Prism 6.0軟件進行統計分析和作圖。所有數據均表示為均數±標準差，并使用One-way ANOVA進行統計分析，P<0.05被認為具有統計學意義。

3 結果

3.1 黃芩素(100 mg/kg)對裸鼠未產生明顯毒副作用

為了闡明黃芩素的安全性，我們檢測了100 mg/kg黃芩素在裸鼠體內是否產生毒副作用。每周檢測各組裸鼠的體重變化，正常對照組和用藥組之間裸鼠體重沒有顯著的差異(見圖1)。此外，圖1中的血生化結果顯示，裸鼠肝功指標ALT、AST和腎功能指標BUN、Cr均沒有統計學差異。

圖1 黃芩素對裸鼠體重及肝腎功能的影響

3.2 黃芩素抑制乳腺癌異種移植瘤裸鼠腫瘤生長和肺轉移

為了觀察黃芩素對乳腺癌生長和轉移的體內作用，采用人乳腺癌MDA-MB-231細胞株建立移植瘤裸鼠肺轉移模型。如圖2結果所示，用藥組裸鼠腫瘤的瘤體體積和重量明顯小于模型組，且差異統計學意義(P<0.01)，其中黃芩素組抑瘤效果弱于紫杉醇組。圖3中裸鼠肺轉移組織病理結果顯示，與正常組比較，其余各組均有癌細胞肺轉移結節，而用藥后轉移結節數和轉移灶明顯小于模型組，紫杉醇組肺轉移率為60%，黃芩素組肺轉移率為80%。該結果表明黃芩素具有明顯抑制乳腺癌原位腫瘤生長和肺轉移的作用。

圖3 黃芩素對移植瘤裸鼠體內腫瘤肺轉移的抑制作用(HE，×100)

圖2 黃芩素對移植瘤裸鼠體內腫瘤生長的抑制作用

3.3 黃芩素和ROCK抑制劑Y-27632抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移

黃芩素在體內實驗中表現出抑制乳腺癌生長和轉移的作用，我們進一步在體外研究黃芩素抑制乳腺癌細胞轉移的作用和機制。通過體外遷移實驗，我們分別用100 μM黃芩素、10 μM Y-27632(Rho下游激酶ROCK的特異性抑制劑)、100 μM黃芩素+10 μM Y-27632處理MDA-MB-231細胞24 h，發現對照組相比，黃芩素和Y-27632(10 μM)均能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞的遷移力(P<0.001)。與單獨使用抑制劑相比，將Y-27632與黃芩素聯合應用后抑制細胞遷移的作用更明顯(P<0.01)(見圖4)。

圖4 黃芩素和Y-27632對MDA-MB-231細胞遷移力的影響

3.4 黃芩素和ROCK抑制劑Y-27632抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞骨架蛋白表達

通過體外細胞遷移實驗證實黃芩素能夠抑制細胞遷移，我們進一步利用細胞熒光化學染色方法，觀察用藥后MDA-MB-231細胞骨架蛋白F-actin的變化。實驗發現未用藥處理的細胞內有明顯的蛋白質纖維束形成，而經黃芩素和Y-27632處理24 h后的細胞骨架蛋白表達被抑制，兩種藥物聯合應用效果更明顯(見圖5)。

圖5 黃芩素和Y-27632對MDA-MB-231細胞遷移力的影響

3.5 黃芩素對乳腺癌MDA-MB-231細胞蛋白表達的影響

通過以上的實驗我們知道黃芩素具有抑制人乳腺癌MDA-MB-231體外遷移的作用，并且該作用與影響細胞骨架蛋白的重組有關。為進一步明確黃芩素在這一過程中影響了哪些蛋白參與調控骨架蛋白重組，我們進行了Western blot實驗。結果如圖6所示，100 μM黃芩素能夠顯著抑制ROCK1(P<0.05)，Rac1(P<0.01)和RhoA(P<0.05)的表達。Rho和ROCK的下游調控蛋白是肌球蛋白輕鏈蛋白MLC。我們發現100 μM黃芩素和10 μM 的Y-27632均能夠明顯抑制MLC的磷酸化(P<0.05)，兩藥合用效果顯著(P<0.01)。這說明黃芩素抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移可能與抑制RhoA-ROCK-MLC信號通路相關。

圖6 黃芩素和Y-27632對MDA-MB-231細胞蛋白表達的影響

4 討論

黃芩素作為黃芩根的有效提取物，在多種癌癥中均顯示出了其抗癌能力[9,10]。有研究表明，黃芩素能夠抑制PI3K/AKT信號傳導誘導乳腺癌細胞凋亡和自噬[11]，通過抑制MMP-2和MMP-9的表達影響乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力[12]。然而，黃芩素抗腫瘤的作用尚未在臨床試驗中得到證實，其抑制乳腺癌細胞遷移的具體機制也尚未解明。本研究在人乳腺癌異種移植瘤裸鼠模型上，觀察到黃芩素能夠抑制乳腺癌原位腫瘤生長和肺轉移，抑制效果不及紫杉醇，但是對裸鼠的體重和肝腎功能均沒有顯著影響，表明黃芩素應用于乳腺癌防治可能是比較安全的，這與既往黃芩素抑制乳腺癌裸鼠肺轉移模型的體內研究結果一致[13]。

腫瘤細胞的遷移運動能力是腫瘤發生轉移的主要原因之一，而細胞的遷移運動受到Rho家族基因的調控。它們通過調控細胞的骨架重組，細胞的黏附和細胞的運動等參與癌轉移[14]。單個或集體腫瘤細胞遷移是這一復雜過程中的關鍵步驟，涉及細胞外基質(ECM)重塑以及與相鄰細胞和與基礎結締組織細胞粘連的動態重組，信號蛋白以及細胞骨架相關的支架成分，以協調的方式介導細胞與ECM的粘附[15]。在本研究中觀察到黃芩素具有抑制MDA-MB-231細胞遷移的作用，與本研究實驗結果相似的是，有研究報道，黃芩素可能通過抑制MMP-9蛋白表達，抑制MDA-MB-231細胞增殖和遷移[16]。

Rho家族蛋白對細胞的遷移運動起調控作用，RhoA是Ras超家族中小分子量的G蛋白成員之一，主要是通過影響細胞骨架參與調控腫瘤細胞的侵襲和轉移[17]。Rac1是Rho家族Rac亞家族的成員，能夠調控細胞生長和細胞骨架重組[18]，是許多細胞過程的多效性調節劑，包括細胞周期，細胞間粘附，以及通過肌動蛋白網絡調節細胞運動性[19]。Rho相關蛋白激酶(ROCK)是一種屬于AGC(PKA/PKG/PKC)絲氨酸-蘇氨酸激酶家族的激酶[20]，是RhoA的下游靶效應分子，它主要通過作用于細胞骨架而參與調節細胞的形狀和運動[21]。已發現大鼠ROCK是Rho的第一個效應物，它們通過使下游肌球蛋白輕鏈MLC的磷酸化來誘導應激纖維的形成和粘著斑[22]，目前已經鑒定出兩個小鼠ROCK同工型ROCK1和ROCK2。我們實驗發現黃芩素同ROCK的特異性抑制劑Y-27632單用或聯合應用能夠改變細胞的骨架重組，抑制細胞遷移，同時抑制ROCK1、Rac1和RhoA的蛋白表達水平，并且抑制MLC的磷酸化。這表明黃芩素抑制癌細胞遷移可能與Rho-ROCK-MLC通路相關。

綜上，黃芩素能夠抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231異種移植瘤裸鼠的腫瘤生長和肺轉移，且無明顯肝腎毒性。而且，黃芩素可能是通過調節Rho-ROCK-MLC通路，影響細胞骨架蛋白表達，從而抑制乳腺癌細胞遷移。