基于計算機模擬技術分析去氫樅酸作為PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑的潛力

李翠萍，陳乃源，李昕宇，盧國棟

1廣西醫科大學口腔醫學院；2廣西醫科大學公共衛生學院；3廣西醫科大學基礎醫學院；4廣西高校高發疾病預防與控制研究重點實驗室，南寧 530021

PI3K/AKT/mTOR信號通路對細胞的增殖、分化和凋亡等過程起著重要作用，在許多腫瘤細胞中存在過度激活的現象，并被發現可促進腫瘤細胞耐藥性的產生[1,2]。而抑制該信號通路的激活能夠促進腫瘤細胞凋亡，也能恢復腫瘤細胞對藥物的敏感性[3]。因此，開發小分子PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑成為抗腫瘤藥物的研究熱點之一[4]。去氫樅酸(DHA)是一種重要的三環二萜類天然樹脂酸，也是傳統中藥松香的成分之一，主要由松香經歧化反應后分離獲得。其性質穩定且具有與甾類分子類似的結構，目前已被廣泛用于熒光試劑和藥物中間體的合成與開發。去氫樅酸及許多它的衍生物表現出良好的抗腫瘤活性[5-7]。近期報道顯示，去氫樅酸的1H苯并[d]咪唑類衍生物對PI3Kα有抑制效果，能夠下調磷酸化AKT的表達[8]。我們的研究也發現，部分B環改性的去氫樅酸衍生物能夠降低磷酸化的PI3K、AKT、mTOR表達水平，同樣也能降低其下游效應器S6和4EBP1的磷酸化水平[9]。雖然不同去氫樅酸衍生物對PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表現出了一定的抑制作用，但去氫樅酸本身是否具有相應的抑制能力，目前尚不清楚，有待進一步的研究。

大多數化合物通過與蛋白分子的結合產生效應作用，其結合模式和結合能力可通過蛋白晶體解析和蛋白熒光猝滅等手段來驗證，但實驗周期較長，成本較高。分子對接技術是一種利用計算機進行理論計算預測化合物與受體蛋白結合情況的手段，可根據對接結合能的大小判斷化合物與蛋白的結合能力，篩選出潛在的蛋白調節劑；也可通過所得的對接構像和其他的對接評分進行初步的機理研究[10-12]。此外，了解化合物在人體的吸收、分布、代謝、排泄和毒性等類藥性和藥代動力學特性可以判斷其是否可作為臨床治療的候選化合物。為了降低研究成本，計算機輔助程序已逐漸被用于類藥性和藥代動力學的初步研究[13,14]。

因此，本研究利用分子對接技術預測去氫樅酸與該通路關鍵蛋白的結合能力和結合方式，并用蛋白免疫印跡法驗證去氫樅酸的實際抑制情況，進一步利用網絡服務器進行類藥性與藥代動力學的模擬，以初步了解去氫樅酸作為PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑的潛力，為進一步開發去氫樅酸提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 分子對接

1.1.1 蛋白數據獲取

本研究選取人癌細胞中過度激活的Ⅰ類PI3K催化亞基p110的四個亞型α、β、γ、δ[15]，AKT的3種亞型AKT1、AKT2、AKT3、以及mTOR[16]進行研究。蛋白質晶體結構主要從RCSB Protein Data Bank(PDB)數據庫(http://www.rcsb.org/)中獲取，蛋白文件ID分別為：PI3Kα(4ZOP)、PI3Kβ(4J6I)、PI3Kγ(3L54)、PI3Kδ(4GB9)、AKT1(3MVH)、AKT2(3D0E)和mTOR(4JT6)，配體均為ATP-競爭抑制劑。AKT3結構的PDB文件通過Phyre2網絡服務器預測得到[17]。

1.1.2 配體文件的準備

蛋白文件中的配體分子經PyMOL Molecular Graphics System(Version 2.0 Schr?dinger,LLC)提取后保留為“.pdb”格式備用。去氫樅酸(圖1)和前期研究中的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制分子(含吡啶-3-甲基胺結構的去氫樅酸衍生物，DBDA)[9]由ChemOffice 2019繪制成3D格式，經MM-2能量優化后保存為“.pdb”格式備用。所有“.pdb”格式文件的分子，經AutoDock 4.2.6軟件(AutoDock)自動選擇可扭轉鍵后保存為PDBQT文件備用。

圖1 去氫樅酸的結構

1.1.3 蛋白文件的準備

利用PyMOL Molecular Graphics System刪除蛋白文件中的配體、水和金屬等小分子，刪除相似性極高的重復蛋白鏈，以保留A鏈為主。利用AutoDock對蛋白進行“加氫”、自動計算“Gasteiger charges”、設置原子類型為“Assign AD4 type”后保存為PDBQT文件備用。

1.1.4 對接的執行

“GridBox”的“grid map”設置為60×60×60以涵蓋ATP位點(中心分別為：PI3Kα，x=-2.4、y=12.3、z=-17.3；PI3Kβ，x=19.0、y=60.0、z=22.0；PI3Kγ，x=22.0、y=15.0、z=22.0；PI3Kδ，x=17.0、y=-5.0、z=21.0；ATK1，x=19.0、y=-3.0、z=28.0；AKT2，x=23.0、y=-18.0、z=7.0；AKT3，x=3.0、y=15.0、z=-42.0；mTOR，x=52.0、y=1.0、z=-47.0)。對接程序使用默認參數進行，選取結合能最低的構像作為預測結果進行分析。當各蛋白原配體重新對接的構像均方根偏差(root mean square deviation，RMSD或refRMS)差小于2?時，則認為此對接方法有較好的準確性[18]。

1.1.5 對接結果分析

配體-蛋白相互作用的3D構像使用PyMOL制作，配體-蛋白相互作用的2D構像使用LigPlot+2.1制作。去氫樅酸與原配體重疊的相互作用殘基用紅圈指示。相互作用殘基是否參與配體-蛋白的結合通過可接觸表面積(accessible surface area，ASA)的損失(ΔASA)來衡量，配體與殘基的相互作用越緊密ΔASA越大，一般ΔASA大于10?2可認為該相互作用參與了配體-蛋白的結合[19]。各殘基的ASA通過Accessible Surface Area and Accessibility Calculation for Protein(ver.1.2)(http://cib.cf.ocha.ac.jp/bitool/ASA/)系統進行計算。各殘基的ΔASA=ASA對接前﹣ASA對接后。

1.2 蛋白免疫印跡測試

取對數生長期的SCC9細胞，向細胞培養皿中加入含有不同濃度藥物(0、13和26 μM的去氫樅酸)的培養基，置37 ℃、5%CO2培養后，用冷PBS洗，進一步用0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集，加入200 μL裂解液(196 μL裂解液加2 μL PMSF和2 μL蛋白磷酸酶抑制劑混合物)(Solarbio)裂解，置于冰上研碎至勻漿后，4 ℃放置30 min，用BCA試劑盒檢測(Beyotime)蛋白濃度，用SDS-PAGE凝膠電泳(Beyotime)對蛋白質進行電泳并轉膜。在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜。次日洗膜后，在室溫下用相應的二抗孵育1 h，最后用化學發光試劑盒顯影(Merck，德國)。使用全能成像系統顯示蛋白條帶(ChemiDoc MP，Bio-Rad，USA)。一抗為：PI3K p110、PI3K p85、p-AKT、AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6，GAPDH作為內參(Cell Signaling Technology，Boston，USA)。

1.3 類藥性與藥代動力學預測

利用網絡服務器“pkCSM-pharmacokinetics”(http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/)對去氫樅酸的類藥性(利賓斯基五法則)和藥代動力學(吸收、分布、代謝、排泄和毒性)進行預測[19]。該預測方法是將已知藥代動力學特性的分子進行圖形建模，轉化成原子間距離參數的識別標志，再用這些識別標志和分子的特性建立藥代動力學的回歸與分類模型。待測分子也轉換成識別標志后代入模型并進行預測。

2 結果

2.1 對接結合能

對接結果顯示(表1)，原配體重新對接的RMSD值均小于2 ?，最大值為0.48 ?，說明對接程序的預測結果能夠很好的重復原配體在蛋白中的構像，對接方法較為可靠。DHA與通路蛋白的最低對接結合能均為負值，最大值為-6.16 kcal/mol，說明DHA可能對這些蛋白的ATP位點均有一定的結合能力。雖然最低對接結合能均高于作為抑制劑的原配體，但與對該通路有抑制作用的DBDA接近。這預示著去氫樅酸可能對該通路也可以表現出抑制能力。

表1 PDB文件信息和最低對接結合能

2.2 去氫樅酸與各PI3K蛋白的對接結果

對PI3Kα的分子對接結果顯示(圖2)，去氫樅酸在PI3Kα的ATP結合位點共與12個殘基發生非鍵相互作用，其中9個殘基Val851、Trp780、Met922、Met772、Ile932、Ile848、Ser854、Gln859和Arg770對配體-蛋白的結合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Trp780的ΔASA(38.99 ?2)最大，可視為關鍵殘基(表2)。有10個殘基與PI3Kα原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對PI3Kα的ATP結合位點有著較為相似的結合方式。

圖2 去氫樅酸與PI3Kα對接的構像

對PI3Kβ的分子對接結果顯示(圖3)，去氫樅酸在PI3Kβ的ATP結合位點與13個殘基發生相互作用，其中氫鍵相互作用殘基2個(Ala885和Lys890)、非鍵相互作用殘基11個。有9個殘基Val882、Trp812、Ala885H、Met953、Ile963、Ile831、Lys890、Ile879和Asp964對配體-蛋白的結合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Ile963的ΔASA (30.642 ?2)最大，可視為關鍵殘基(表2)。此外，有10個殘基與PI3Kβ原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對PI3Kβ的ATP結合位點有著較為相似的結合方式。

圖3 去氫樅酸與PI3Kβ對接的構像

對PI3Kγ的分子對接預測顯示(圖4)，去氫樅酸在PI3Kγ的ATP結合位點共與12個殘基發生相互作用，其中與氫鍵相互作用殘基1個(Lys890)、非鍵相互作用殘基11個。有8個殘基Met804、Asp964、Met953、Ile963、Ile831、Ser806、Ile879和Lys890對配體-蛋白的結合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Met804的ΔASA(49.215 ?2)最大，可視為關鍵殘基(表2)。有9個殘基與PI3Kγ原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對PI3Kγ的ATP結合位點有著較為相似的結合方式。

圖4 去氫樅酸與PI3Kγ對接的構像

對PI3Kδ的分子對接結果顯示(圖5)，去氫樅酸在PI3Kδ的ATP結合位點與13個殘基發生相互作用，其中氫鍵相互作用殘基1個(Lys890)、非鍵相互作用殘基12個。有7個殘基Met953、Lys890、Ile963、Met804、Ile879、Ile831和Ser806對配體-蛋白的結合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Lys890的ΔASA(43.805 ?2)最大，可視為關鍵殘基(表2)。有11個殘基與PI3Kδ原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對PI3Kδ的ATP結合位點有著較為相似的結合方式。

圖5 去氫樅酸與PI3Kδ對接的構像

表2 去氫樅酸與PI3K相互作用殘基信息

續表2(Continued Tab.2)

2.3 去氫樅酸與各AKT蛋白的對接結果

對AKT1的分子對接結果顯示(圖6)，去氫樅酸在AKT1的ATP結合位點與15個殘基發生相互作用，其中氫鍵相互作用殘基2個(Thr211和Ala230)、非鍵相互作用殘基13個。有10個殘基Glu234、Asp292、Val164、Leu156、Arg4 (B)、Met281、Met227、Gly157、Ala177和Thr291對配體-蛋白的結合起著重要作用(ΔASA>10?2)，殘基Val164的ΔASA (40.176?2)最大，可視為關鍵殘基(表3)。有12個殘基與AKT1原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對AKT1的ATP結合位點有著較為相似的結合方式。

圖6 去氫樅酸與AKT1對接的構像

對AKT2的分子對接結果顯示(圖7)，去氫樅酸在AKT2的ATP結合位點與13個殘基發生非鍵相互作用，其中8個殘基Lys181、Asp293、Val166、Glu236、Met229、Gly159、Thr292和Met282對配體-蛋白的結合起著重要作用(ΔASA>10?2)，殘基Val166的ΔASA (30.756?2)最大，可視為關鍵殘基(表3)。有11個殘基與AKT2原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸和原配體對AKT2的ATP結合位點有著較為相似的結合方式。

圖7 去氫樅酸與AKT2對接的構像

對AKT3的分子對接結果顯示(圖8)，去氫樅酸在AKT3的ATP結合位點與14個殘基發生非鍵相互作用，其中9個殘基Leu154、Val228、Val162、Met278、Gly155、Met225、Asp289、Lys177和Gly157對配體-蛋白的結合起著重要作用(ΔASA>10?2)，殘基Met278的ΔASA(41.586?2)最大，可視為關鍵殘基(表3)。近半數的殘基與AKT1原配體的相互作用殘基重疊，說明去氫樅酸與AKT1配體在一定程度上對AKT3的ATP結合位點有著相似的結合方式。

圖8 去氫樅酸與AKT3對接的構像

表3 去氫樅酸與AKT相互作用殘基信息

2.4 去氫樅酸與mTOR蛋白的對接結果

對mTOR的分子對接結果顯示(圖9)，去氫樅酸在mTOR的ATP結合位點與13個殘基發生相互作用，其中氫鍵相互作用殘基1個(Val2240)、非鍵相互作用殘基12個。有9個殘基Trp2239、Ile2356、Ile2237、Met2345、Leu2185、Cys2243、Thr2245、Ala2248和Asp2244對配體-蛋白的結合起著重要作用(ΔASA>10 ?2)，殘基Trp2239的ΔASA(50.969 ?2)最大，可視為關鍵殘基(表4)。近半數的殘基與mTOR原配體的相互作用殘基重疊，這說明去氫樅酸與原配體可能在一定程度上對mTOR的ATP結合位點有著相似的結合方式。

圖9 去氫樅酸與mTOR對接的構像

表4 去氫樅酸與mTOR相互作用殘基信息

2.5 蛋白免疫印跡結果

蛋白免疫印跡結果顯示(圖10)，在去氫樅酸的作用下，SCC9的PI3K催化亞基p110的表達略有下調，調控亞基p85的表達明顯下調；PI3K下游蛋白AKT和mTOR的磷酸化明顯被抑制，但其總蛋白的表達基本不受影響；通路下游的效應蛋白4EBP1的磷酸化略受抑制，S6的磷酸化明顯減少。這說明PI3K/AKT/mTOR信號通路受到去氫樅酸的抑制。

圖10 去氫樅酸對蛋白表達的影響

2.6 類藥性與藥代動力學預測結果

類藥性預測結果經“五倍率法則(Lipinski rule of five)”比較(表5)：去氫樅酸的分子量、油水分配系數(LogP)、可旋轉鍵(rotatable bonds)、氫鍵受體(acceptors)、氫鍵供體(donors)和總極化表面積(surface area)均在可接受值域內。

表5 去氫樅酸類藥性預測數據

藥代動力學預測結果顯示(表6)：去氫樅酸有較好的脂溶性和口服作用，容易通過腸道吸收，且不作為P-糖蛋白的底物；較易分布于血液，易穿透血腦屏障、穿透中樞神經；對機體的代謝能力沒有影響；可以被正常排泄；不致突變，毒性較小。總的來說去氫樅酸通過了大多數的預測，成為安全藥物的可能性較大，可考慮作為治療使用的候選化合物[19]。

表6 去氫樅酸藥代動力學預測數據

續表6(Continued Tab.6)

3 討論

PI3K/AKT/mTOR信號通路對細胞的增殖、分化和凋亡等過程起著重要作用，也是癌癥治療的靶點之一。PI3K主要由催化亞基p110和調控亞基p85構成，經磷酸化激活后，可將其底物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)轉化成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。PIP3能夠與AKT結合后通過磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)促使AKT磷酸化。經磷酸化激活的AKT能夠直接或間接的使mTOR磷酸化，從而進一步促進下游效應蛋白4EBP1和S6的磷酸化以調控細胞內生化活動[20,21]。

本研究基于近年來去氫樅酸抗癌衍生物不斷被開發，部分衍生物被報道對PI3K/AKT/mTOR信號通路的部分關鍵蛋白有抑制作用[8,9,22]。為了研究作為原料的去氫樅酸對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響，為去氫樅酸抗癌衍生物的開發提供依據。利用分子對接技術預測了去氫樅酸對通路關鍵蛋白PI3K，AKT和mTOR的ATP結合位點的結合能力和結合方式，利用蛋白免疫印跡法檢驗去氫樅酸對通路的抑制效果，通過初步的類藥性和藥代動力學模擬預測去氫樅酸成為口服藥物的潛力。

分子對接結果表明，去氫樅酸對各關鍵蛋白的ATP結合位點均有一定的結合能力，與AKT3的結合最弱，最低結合能為-6.16 kcal/mol，與AKT1結合最強，最低結合能為-8.04 kcal/mol。去氫樅酸對通路蛋白的結合能力弱于作為高效抑制劑的原配體，與我們已合成得到的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制分子DBDA相近。在ATP結合位點中，去氫樅酸與蛋白的相互作用殘基多為含疏水性殘基。除了PI3Kδ的Lys890，其他對配體-蛋白結合起最重要作用的關鍵殘基也均為疏水性殘基。說明去氫樅酸可能通過與ATP結合位點的腺嘌呤區結合從而產生抑制作用[23]。各蛋白與去氫樅酸的相互作用殘基跟原配體的有著大量的重疊，這表明去氫樅酸可能是以和原配體相近的方式與ATP展開競爭以抑制蛋白作用。此外，沒有氫鍵存在的構像，如去氫樅酸與PI3Kα、AKT2和AKT3，它們的結合能均高于其他存在氫鍵的構像，這表明氫鍵對去氫樅酸與蛋白的穩定結合發揮著重要作用。在去氫樅酸結合的構像中，氫鍵全部在羧基位置產生。但是，異丙基和苯環附近存在多個在原配體中為氫鍵相互作用的重疊殘基。這一特征提示，在設計新的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑時，可加強羧基位置的親水能力，并在異丙基和苯環位置引入親水基團，可能可以提高新化合物與蛋白的結合能力。

蛋白免疫印跡實驗顯示，SCC9細胞經去氫樅酸處理后，PI3K調控亞基p85的表達明顯降低。p85含量的減少可能使PI3K的生成受阻，并成為減少PI3K下游蛋白AKT磷酸化表達的因素之一。AKT和mTOR的總蛋白在不同濃度的去氫樅酸作用下與空白組相比沒有明顯的變化，但其磷酸化蛋白表達均明顯減少，說明AKT和mTOR的磷酸化進程受到抑制。處于mTOR下游的4EBP1的磷酸化表達下降較少，可能是因為4EBP1還可經MEK/Erk信號通路激活的原因[24]。而受mTOR調控的另一效應蛋白S6K1下游的S6磷酸化表達明顯減少，可能是因為mTOR的磷酸化受阻，導致S6K1激活減少，從而減少了S6的磷酸化反應。總的來說在SCC9細胞內，PI3K/AKT/mTOR信號通路的表達受到了去氫樅酸的抑制，這與分子對接中預測的結果一致。

類藥性和藥代動力學預測中，去氫樅酸的五倍率法則(Lipinski rule of five)分析顯示，其分子量、LogP、旋轉鍵、氫鍵受體、氫鍵供體的值均在該經驗性規則要求的范圍內[25]。藥代動力學預測對去氫樅酸在體內的吸收、分布、代謝、排泄和毒性等性能進行模擬，去氫樅酸通過了大部分的測試，說明它可能可以較好的在體內發揮藥物作用[19]。

總之，本研究通過分子對接預測、蛋白免疫印跡實驗、類藥性檢驗和藥代動力學預測，發現去氫樅酸本身可能成為一種候選的治療藥劑，用于抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，以達到緩解腫瘤細胞耐藥和抗腫瘤的目的。也可以進一步對去氫樅酸的結構進行修飾，以開發出更有效的去氫樅酸基PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑。