基于血清藥物化學的厚藤治療急性痛風性關節炎質量標志物研究

侯小濤，韋棪婷，夏中尚，韋 瑋，郝二偉，杜正彩，周月敏，鄧家剛*

基于血清藥物化學的厚藤治療急性痛風性關節炎質量標志物研究

侯小濤1, 2，韋棪婷1, 2，夏中尚2, 3，韋 瑋2，郝二偉2，杜正彩2，周月敏1，鄧家剛2*

1. 廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200 2. 廣西中醫藥大學 廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西 南寧 530200 3. 成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

基于中藥質量標志物（quality marker，Q-Marker）的概念，研究厚藤提取物對急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis，AGA）大鼠的治療作用，并分析厚藤提取物在正常大鼠及AGA大鼠的血中移行成分，為厚藤Q-Marker的確定提供依據。采用尿酸鈉建立AGA大鼠模型，考察厚藤提取物對AGA大鼠關節腫脹指數、足墊腫脹程度和滑膜組織病理變化的影響，考察厚藤提取物對AGA大鼠血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、巨噬細胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）和MIP-2水平的影響。采用液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜（LC-Q-TOF-MS/MS）技術對厚藤提取物進行定性分析，探尋正常大鼠和AGA大鼠ig厚藤提取物后的入血成分。與模型組比較，厚藤提取物組大鼠關節腫脹指數和足墊厚度均顯著降低（＜0.05、0.01），厚藤提取物高、中劑量組大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平均顯著降低（＜0.05），厚藤提取物高、中劑量組大鼠滑膜組織炎性細胞浸潤減輕。從厚藤提取物中鑒定出樹脂糖苷類、黃酮類、有機酸類、香豆素類、核苷類、木脂素類等53個成分，其中有機酸類和黃酮類為其主要成分，并推測了樹脂糖苷類、黃酮類、有機酸類、香豆素類部分成分的裂解規律；正常大鼠含藥血漿中鑒定出蘋果酸、咖啡酸、咖啡酸甲酯和對羥基苯甲酸4個成分，AGA大鼠含藥血漿中鑒定出莨菪亭、咖啡酸、咖啡酸甲酯和對羥基苯甲酸4個成分。厚藤提取物能夠明顯改善AGA大鼠關節腫脹，抑制血清中IL-1β、MIP-1α及MIP-2水平，并抑制炎癥反應；采用LC-Q-TOF-MS/MS技術可快速鑒定厚藤水提物的主要成分為有機酸類和黃酮類，莨菪亭、咖啡酸、綠原酸及其異構體（新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）和原兒茶酸在AGA大鼠中以原型成分或代謝物形式入血，可作為厚藤治療AGA的Q-Marker。

厚藤；急性痛風性關節炎；質量標志物；液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜；莨菪亭；咖啡酸；綠原酸；新綠原酸；隱綠原酸；異綠原酸B；異綠原酸A；異綠原酸C；原兒茶酸

痛風是嘌呤代謝紊亂造成皮下組織、關節周圍、骨骼及尿路中尿酸鹽結晶沉淀而引發的病變，我國痛風發病率1%～3%，為僅次于糖尿病的第2大代謝類疾病[1-2]。急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis，AGA）是痛風急性發作期的首發癥狀，其發病機制與炎癥反應和高尿酸血癥密切相關[3]。目前臨床上針對AGA的化學藥物多為秋水仙堿、非甾體類抗炎藥物、糖皮質激素等[4]，普遍存在不良反應，臨床應用上受到一定的限制。目前越來越多的研究從中西醫結合的途徑入手，探索中醫藥在治療AGA的優勢。

厚藤(Linn.) Sweet為旋花科番薯屬植物，是我國南方沿海地區常用的海洋中藥，其味辛、苦，性微寒，歸肺、肝、胃、大腸經，具有祛風除濕、消癰散結、拔毒消腫的功效，常用于治療腰肌勞損、風濕關節痛等疾病[5-6]。厚藤具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節等多種藥理活性[7]。抗炎活性與厚藤祛濕拔毒等傳統功效密切相關，被認為是其主要的藥效作用。目前其抗炎活性研究多停留在驗證傳統功效層面，未見對其作用機制進行深入研究的報道，也未見對其化學成分與藥理作用之間關聯性進行研究的報道。基于劉昌孝院士[8]提出質量標志物（quality marker，Q-Marker）的概念，本研究利用液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜（LC-Q-TOF-MS/MS）技術，在藥物有效的前提下，分別對正常大鼠和AGA大鼠ig厚藤提取物后的含藥血漿進行分析，為厚藤Q-Marker的確定及其藥材的質量標準研究提供依據和思路。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質量（200±10）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。動物飼養于溫度（23±2）℃、濕度50%～60%、12 h/12 h晝夜交替光照的環境中，自由進食飲水。動物實驗經廣西中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準號DW20190418-015）。

1.2 藥材

厚藤于2019年4月20日采自廣西防城港市北侖河口國家級自然保護區，經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為旋花科植物厚藤(L.) Sweet。

1.3 藥品與試劑

尿酸鈉（批號U2875-5G）購自美國Sigma公司；秋水仙堿片（批號180101）購自西雙版納版納藥業公司；4%多聚甲醛（批號70120900）購自Biosharp公司；EDTA脫鈣液（批號E1171）購自北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、巨噬細胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）、MIP-2多因子試劑盒（批號64325505）購自美國BIO-RAD公司；質譜級甲醇、乙腈購自美國Thermo Fisher Scientific公司）；色譜級甲酸購自日本TCI公司；異槲皮苷對照品（批號DST180108-006）購自德思特生物公司；綠原酸對照品（批號AF8112791）購自成都埃法生物科技公司；異莨菪亭對照品（批號PS020323）購自成都普思生物科技公司）；阿魏酸對照品（批號MUST-18032928）購自成都曼思特生物公司；對照品秦皮乙素（批號190329）、異綠原酸C（批號190507）、異綠原酸A（批號190423）、異綠原酸B（批號160822）、咖啡酸（批號160803）購自上海融禾醫藥科技有限公司；以上對照品質量分數均≥98%。

1.4 儀器

ExionLC AC液相色譜儀、X500R QTOF質譜儀、SCIEX OS 2.0數據處理軟件（美國SCIEX公司）；CPA225D萬分之一天平（德國賽多利斯科學儀器北京公司）；KQ-500DE型數控超聲儀（昆山市超聲儀器公司）；Hei-VAP型旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；X-200 Luminex多功能流式點陣儀（美國Luminex公司）。

2 方法

2.1 厚藤提取物的制備

稱取厚藤地上部分粗段，加入12倍量水煮沸后再煎30 min，濾過；再加入10倍量水提取1次，合并2次濾液，55 ℃減壓濃縮至稠膏。

2.2 動物分組、造模與給藥

大鼠隨機分為對照組、模型組、秋水仙堿（0.27 mg/kg）組和厚藤提取物高、中、低劑量（928.80、464.40、222.90 mg/kg，分別相當于成人每日服用生藥材50、25、12 g）組，每組10只，另隨機選取3只作為正常給藥組。各給藥組ig相應藥物，正常給藥組ig厚藤提取物（928.80 mg/kg），對照組和模型組ig等體積純化水，1次/d，連續7 d。第7天給藥1 h后，大鼠ip 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，正常給藥組和對照組大鼠于右后側踝關節腔注射0.1 mL無菌生理鹽水，其余各組大鼠于右后側踝關節腔注射0.1 mL尿酸鈉溶液（0.5 g/10 mL），建立AGA模型[9]。造模后，各給藥組ig相應藥物，1次/d，連續2 d。

2.3 厚藤提取物對AGA大鼠踝關節腫脹指數和右后足墊厚度的影響

造模后觀察各組大鼠關節腫脹和右后足墊腫脹程度，并計算關節腫脹指數。

關節腫脹指數＝測定時間點關節周徑－初始關節周徑

2.4 厚藤提取物對AGA大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平的影響

大鼠禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h，腹主動脈采血至含肝素鈉的采血管中，3000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定各組大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平。

2.5 厚藤提取物對AGA大鼠滑膜組織病理變化的影響

大鼠脫頸椎處死，取各組大鼠踝關節滑膜組織，浸泡于4%多聚甲醛中，脫鈣后包埋于石蠟中制成組織塊，隨后采用蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察滑膜組織病理變化。

2.6 供試品溶液的制備

取適量厚藤提取物稠膏于蒸發皿中，55 ℃水浴烘干，取0.1 g提取物粉末，精密稱定，加入20 mL 50%甲醇，密塞稱定質量，超聲提取30 min，冷卻至室溫后再次稱定質量，以50%甲醇補足質量，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.7 對照品溶液的制備

分別取秦皮乙素、咖啡酸、異槲皮苷、異莨菪亭、綠原酸對照品適量，精密稱定，加入甲醇配制成各成分質量濃度為10 μg/mL的混合對照品溶液。分別取異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、阿魏酸適量，加入甲醇配制成質量濃度為10 μg/mL的對照品溶液。

2.8 血漿樣品的制備

將正常給藥組、對照組、模型組、厚藤提取物高劑量組同組血漿混合，各吸取1 mL，加入3倍量甲醇-乙腈（1∶1）溶液沉淀蛋白，渦旋3 min，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，氮氣吹干至固狀，殘渣加入200 μL甲醇，超聲3 min，渦旋混勻1 min，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，吸取上清液進行分析。

2.9 厚藤成分庫的建立

通過CNKI、PubMed等數據庫檢索與厚藤相關的文獻，對厚藤的化學成分進行總結，共檢索到119個化學成分；利用ChemBioDraw軟件、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Chemicalbook（https://m.chemicalbook.com/）等平臺收集化學成分的名稱、分子式、結構式、相對分子質量等信息。

2.10 色譜條件

Hypersil Gold色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），洗脫程序：0～30 min，5%～95% B；體積流量為0.4 mL/min；進樣量為3 μL；柱溫為40 ℃。

2.11 質譜條件

雙噴霧TurboV離子源；正/負離子掃描方式；掃描范圍為/100～1500；正離子源電壓為5500 V，負離子源電壓為?4500 V；離子源溫度為600 ℃；霧化氣壓力為55 psi（1 psi＝6.895 kPa），輔助氣壓力為55 psi，氣簾氣壓力為35 psi；母離子碰撞能量為?10 V；去簇電壓為?80 V；子離子碰撞能量為?35 V。

2.12 數據處理

3 結果

3.1 厚藤提取物對AGA大鼠踝關節腫脹指數的影響

如表1所示，與對照組比較，造模后第4～24小時，模型組大鼠踝關節腫脹指數顯著升高（＜0.01），于造模后第12小時達到腫脹高峰。與模型組比較，造模后第24～48小時，厚藤提取物組大鼠踝關節腫脹指數顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.2 厚藤提取物對AGA大鼠右后足墊厚度的影響

如表2所示，與對照組比較，造模后第4～24小時，模型組大鼠右后足墊厚度顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，造模后第8、24小時，厚藤提取物組大鼠右后足墊厚度顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.3 厚藤提取物對AGA大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，厚藤提取物高、中劑量組大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平顯著降低（＜0.05）。

表1 厚藤提取物對AGA大鼠踝關節腫脹指數的影響()

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

表2 厚藤提取物對AGA大鼠右后足墊厚度的影響()

表3 厚藤提取物對AGA大鼠血清中IL-1β、MIP-1α和MIP-2水平的影響()

3.4 厚藤提取物對AGA大鼠滑膜組織病理變化的影響

如圖1所示，對照組大鼠滑膜結構清晰完整，滑膜組織無炎性細胞浸潤及纖維組織增生；模型組大鼠滑膜襯里層較多炎性細胞浸潤，以核分葉的中性粒細胞和圓形深染的淋巴細胞為主，有少量滑膜細胞變性壞死，壞死細胞核固縮或崩解、胞質淡染，血管輕度充血且擴張，管腔內充斥大量紅細胞；秋水仙堿組和厚藤提取物高、中劑量組大鼠滑膜結構較清晰，少量襯里層組織脫落，襯里層內炎性細胞浸潤明顯減輕；厚藤提取物低劑量組大鼠滑膜仍有輕度充血及炎性細胞浸潤現象。

圖1 厚藤提取物對AGA大鼠滑膜組織病理變化的影響(HE, ×400)

3.5 厚藤提取物中的化學成分及其質譜裂解規律解析

采用LC-Q-TOF-MS/MS技術，參照厚藤成分庫、SCIEX數據庫、對照品比對及現有文獻報道，對厚藤提取物中的主要成分進行分析，共鑒定出53個化學成分，包括樹脂糖苷類成分3個、黃酮類成分10個、有機酸類成分26個、香豆素類成分5個、核苷類成分2個、氨基酸類成分2個、萜類成分2個、木脂素類成分1個、刺五加苷類成分1個和維生素類成分1個，并推測了部分化學成分的裂解途徑。厚藤提取物總離子流圖見圖2，鑒定成分及碎片信息見表4。

圖2 負離子模式(A) 和正離子模式(B)下厚藤水提取物的總離子流圖

表4 厚藤提取物中化學成分的鑒定

續表4

續表4

3.5.1 樹脂糖苷類化合物質譜分析 樹脂糖苷類化合物又稱大環內酯類化合物，其結構復雜，一般由長鏈脂肪酸作為苷元與不同數量、種類的單糖形成內酯，主要分布于旋花科番薯屬植物中[29]。以pescapreins XXX為例，負離子模式下，得到/1 267.705 3 [M＋FA－H]－的準分子離子峰；二級碎片離子/1 221.700 4為丟失甲酸形成的[M－H]－的離子峰，/1 049.557 3為丟失一長鏈脂肪酸形成的碎片離子[M－H－C10H20O2]－，/417.285 8為/1 049.557 3發生糖苷鍵斷裂形成的[M－H－C10H20O2－C29H44O15]－的碎片離子，/163.061 6為/417.285 8丟失長鏈脂肪酸形成的[M－H－C10H20O2－C29H44O15－C16H30O2]－；根據該化合物的精確相對分子質量、二級碎片裂解方式，鑒定為pescapreins XXX，其二級質譜圖見圖3，可能的裂解途徑見圖4。

圖3 pescapreins XXX的二級質譜圖

圖4 pescapreins XXX的質譜主要斷裂途徑

3.5.2 黃酮類化合物質譜分析 黃酮類化合物在自然界廣泛存在，是中草藥的主要有效成分之一。以化合物32、33為例，在負離子模式下，R分別為5.52、5.66 min，分別得到/463.086 1 [M－H]－和/463.086 7 [M－H]－的準分子離子峰，在二級質譜信息中都具有/300、301、271、255的碎片，分別對應[M－H－Glc－H]－、[M－H－Glc]－、[M－H－Glc－CO－2H]－、[M－H－Glc－CO－OH－H]－，根據其裂解規律文獻對照[22]推測為異槲皮苷或槲皮素-7--β--葡萄糖苷，因R不同，依據反相色譜柱洗脫原理，鑒定化合物32為異槲皮苷，化合物33為槲皮素-7--β--葡萄糖苷，其二級質譜圖見5，以異槲皮苷為例，可能的裂解途徑見圖6。

3.5.3 有機酸類化合物質譜分析 厚藤含有的有機酸類成分較多，主要為2～3種成分的同分異構體及其衍生物的奎尼酸類成分，在二級質譜中容易丟失H2O、CO2等分子。化合物37、38、42的R分別為6.24、6.35、6.94 min，在負離子模式下，得到相同/515 [M－H]－的分子離子峰，在二級質譜中，因失去2個咖啡酰基，具有/353、191、179、173的特征性碎片離子，推測為異綠原酸。異綠原酸B對照品的R為6.14 min，異綠原酸A對照品的R為6.26 min，異綠原酸C對照品的R為6.80 min，都具有/353、191、179、173、135的二級碎片，根據與對照品比對、反相色譜柱洗脫原理及文獻對照[20]，推測化合物37、38、42分別為異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。以異綠原酸A為例，其二級質譜圖見圖7，可能的斷裂途徑見圖8。

圖5 異槲皮苷(A)和槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(B) 的二級質譜

圖7 異綠原酸A的二級質譜圖

圖8 異綠原酸A的質譜主要斷裂途徑

3.5.4 香豆素類化合物質譜分析 以化合物12為例，R為2.50 min，準分子離子峰為/339.072 7 [M－H]－，二級質譜信息顯示有/177.019 5、133.030 4，是由準分子離子丟失1個Glc，繼續丟失1個CO2形成的碎片離子，根據該化合物一級質譜信息、二級裂解方式及文獻報道[10]，鑒定為秦皮甲素，其二級質譜圖見圖9，可能的裂解途徑見圖10。

化合物28的R為5.09 min，在正離子模式下得到/193.048 9 [M＋H]＋的準分子離子峰，以該母離子進行MS/MS掃描，得到二級碎片離子/178.028 0，為準分子離子丟失1分子CH3形成；碎片離子/133.029 9為準分子離子丟失1分子CH3OH繼而丟失1分子CO形成；碎片離子/150.033 2為母離子丟失1分子CH3后，再丟失1分子CO形成，繼續丟失1分子CO形成/122.038 1的離子碎片。根據以上裂解方式，結合對照品及文獻比對[14]，鑒定該化合物為異莨菪亭。其二級質譜圖見圖11，可能的裂解途徑見圖12。

圖9 秦皮甲素的二級質譜圖

圖10 秦皮甲素的質譜主要斷裂途徑

3.6 厚藤在正常及AGA大鼠中入血成分鑒定

將對照組、正常給藥組、模型組、厚藤高劑量組血漿樣品分別在正、負離子模式下進行分析，給藥組得到的數據扣除對照組的內源性成分，篩選只含在給藥組血漿樣品而不在對照組血漿樣品的成分為入血成分；同理，厚藤高劑量組得到的數據扣除模型組的內源性成分。將入血成分的精確相對分子質量、二級碎片等信息與厚藤提取物鑒定結果比對，若一致，則為原型入血成分。從正常給藥組初步鑒定4個入血成分，從厚藤提取物高劑量組初步鑒定出4個入血成分，2組中相同成分有3個。入血成分鑒定信息見表5、6，總離子流圖見圖13、14，提取離子流色譜圖見圖15、16。

3.7 厚藤在正常及AGA大鼠中入血成分分析

正常大鼠血漿中，R為0.69 min的化合物在負離子模式下，得到/133.0146 [M－H]－的準分子離子峰，其二級碎片主要有/115.005 7 [M－H－H2O]－、/71.014 5 [M－H－H2O－COOH]－，根據該化合物精確相對分子質量、二級質譜信息，并和厚藤提取物鑒定結果比對，鑒定為蘋果酸，其二級質譜圖見圖17。R為2.87 min的化合物在負離子模式下，得到/179.035 3 [M－H]－的準分子離子峰，二級質譜信息顯示主要有/135.0450 [M－H－COOH]－，根據該化合物精確相對分子質量、二級質譜信息，并和厚藤提取物鑒定結果比對，鑒定為咖啡酸，其二級質譜圖見圖17。R為3.04 min的化合物在負離子模式下，得到/193.050 6 [M－H]－的準分子離子峰，比咖啡酸準分子離子峰/179 [M－H]－多14，提示增加1個CH2，發生甲基化反應，結合二級碎片信息/178.025 7 [M－H－CH3]－、/134.037 4 [M－H－CO2－CH3]－，與咖啡酸二級質譜信息比較，符合咖啡酸甲基化過程。根據該化合物一級質譜信息、二級質譜信息并與文獻比對，鑒定為咖啡酸甲酯[30]，其二級質譜圖見圖17。R為6.31 min的化合物在負離子模式下，得到/137.024 5 [M－H]－的準分子離子峰，二級碎片主要有/93.034 9 [M－H－CO2]－、/65.040 0 [M－H－CO2－CO]－，根據該化合物一級質譜信息、二級質譜信息并與文獻對照[31]，鑒定為對羥基苯甲酸，推測為單咖啡酰基奎寧酸類（綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸）在體內代謝成奎尼酸而進一步代謝生成對羥基苯甲酸[32-33]，或是原兒茶酸在體內發生去羥基化反應生成，其二級質譜圖見圖17。

圖11 異莨菪亭的二級質譜圖

圖12 異莨菪亭的質譜主要斷裂途徑

表5 厚藤提取物在正常大鼠中入血成分鑒定結果

表6 厚藤提取物在AGA大鼠中入血成分鑒定結果

圖13 負離子模式下對照組(A)、空白給藥組(B)、模型組(C) 和厚藤提取物高劑量組(D) 血漿樣本的總離子流圖

圖14 正離子模式下對照組(A)、空白給藥組(B)、模型組(C) 和厚藤提取物高劑量組(D) 血漿樣本的總離子流圖

圖15 厚藤提取物在正常大鼠中入血成分的提取離子流色譜圖

圖16 厚藤提取物在AGA大鼠中入血成分的提取離子流色譜圖

AGA大鼠血漿中，R為3.02的化合物在正離子模式下，得到/193.050 1 [M＋H]＋的準分子離子峰，其二級碎片主要有/178.026 8 [M＋H－CH3]＋、/150.033 0 [M＋H－CH3－CO]＋、/133.030 7 [M＋H－CH3－CO2]＋，根據該化合物精確相對分子質量、二級質譜信息，并與厚藤提取物鑒定結果比對，鑒定為莨菪亭，其二級質譜圖見圖17。AGA大鼠中移行成分除莨菪亭外，其余鑒定成分均與厚藤提取物在正常大鼠血漿中移行成分一致。

4 討論

AGA是尿酸鈉晶體沉積所致的關節疾病，臨床表現為關節紅、腫、熱、痛，在中醫屬“痹證”等范疇[34-35]。其發病機制主要涉及代謝、免疫調節與炎癥反應。單鈉尿酸鹽作為危險信號，可活化含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLR family Pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎癥小體，產生大量IL-1β，引起炎癥反應[36]，IL-1β在AGA的發病過程中起著關鍵作用。單鈉尿酸鹽晶體可迅速誘導巨噬細胞趨化因子MIP-1α、MIP-2水平升高，促使巨噬細胞活化[37]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠關節、足墊顯著腫脹，血清中IL-1β、MIP-1α、MIP-2水平均升高，滑膜組織有較多炎性細胞浸潤、血管充血現象，表明AGA模型制備成功；與模型組比較，秋水仙堿組和厚藤提取物高、中劑量組大鼠關節及足墊腫脹明顯緩解，血清中IL-1β、MIP-1α、MIP-2水平均降低，滑膜炎性細胞浸潤減輕，表明厚藤提取物可抑制AGA大鼠炎癥反應。

傳統中藥為口服中藥，口服藥進入機體后經歷復雜的代謝過程，只有吸收入血的成分才可能發揮藥效。中藥血清藥物化學的概念，為研究中藥藥效的物質基礎研究提供了科學方法[38]。本研究采用LC-Q-TOF-MS/MS技術首先對厚藤提取物中的化學成分進行表征，繼而對厚藤提取物在正常大鼠及AGA大鼠中的入血成分進行分析，結果表明，厚藤提取物中主要成分為有機酸類化合物，其中主要包括咖啡酸、綠原酸、異綠原酸等奎尼酸類化合物及其衍生物，其次為山柰酚、異槲皮苷等黃酮類化合物。有機酸類[39]和黃酮類[40]成分具有抗炎活性，與厚藤的傳統藥效吻合。中藥血清藥物化學研究的給藥設計、采血時間及采血方式有多種，本研究采取與厚藤提取物高劑量組同等劑量、1次/d、連續7 d的給藥方式，確保中藥絕大多數成分在體內血藥濃度維持在一個基本穩定的水平。研究發現[41]，最佳的采血時間是在動物給藥后0.5～2 h。采血方式通常有腹主動脈采血、眼眶靜脈叢采血等方法。腹主動脈采血可獲得大量血液且不易發生溶血，適用于單次采血；眼眶靜脈叢采血可實現短時間內多次取血，但采血量較少。因考慮與厚藤提取物在AGA大鼠入血成分研究的采血方式平行，若采用眼眶靜脈叢多次采血可能會對大鼠產生炎癥或應激反應的影響，且AGA為急性模型，大鼠會出現自愈現象，不能確保末次采血時動物維持在病理狀態。綜上，本研究采取末次給藥后1 h腹主動脈采血。ig厚藤提取物后，從正常大鼠血漿中鑒定出蘋果酸、咖啡酸、咖啡酸甲酯、對羥基苯甲酸4種成分；在AGA大鼠血漿中鑒定出咖啡酸、莨菪亭、咖啡酸甲酯、對羥基苯甲酸4種成分，除莨菪亭外，其余成分均與厚藤提取物在正常大鼠血漿中移行成分一致。造成上述情況的原因可能是大鼠在正常狀態和病理狀態下對藥物的吸收有一定差異[42]。在病理狀態下檢測厚藤入血成分更能體現藥物臨床病理狀態下體內過程的特點。其中，莨菪亭為原型成分吸收入血，咖啡酸不僅是厚藤中的化學成分，也是綠原酸及其異構體（新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）水解后的代謝產物[32-33,43]，咖啡酸甲酯為咖啡酸發生甲基化反應形成，對羥基苯甲酸可由單咖啡酰基奎寧酸類代謝產生或由原兒茶酸發生去羥基化反應生成。因此，莨菪亭、咖啡酸、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C及原兒茶酸可作為厚藤治療AGA的Q-Marker。研究發現，咖啡酸可有效緩解類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）大鼠足腫脹和炎癥細胞浸潤，降低足跖中核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、殼多糖酶3樣蛋白1（chitinase-3-like protein 1，CHI3L1）、IL-1β、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達，從而發揮抗RA作用[44]。原兒茶酸能夠抑制NF-κB和蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白（Akt/mTOR）信號通路，從而抑制RA成纖維樣滑膜細胞的增殖與遷移[45]。異綠原酸A抗炎活性可能與抑制NLRP3炎性復合體激活和NF-κB磷酸化表達有關[46]。綠原酸和咖啡酸可通過清除細胞內活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），抑制p38級聯磷酸化和NF-κB信號通路來抑制IL-8生成，從而發揮抗炎作用[47]。莨菪亭能夠通過作用于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）/環磷酸腺苷反應單元結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）通路，抑制成纖維樣滑膜細胞產生IL-6，從而改善佐劑型關節炎大鼠滑膜炎癥和軟骨破壞[48]。本研究鑒定到的原型成分較少，在二級質譜中碎片離子響應較低，推測可能為中藥水煎液成分復雜，各成分含量較低，導致吸收入血的藥物濃度更低。

A-蘋果酸 B-咖啡酸 C-咖啡酸甲酯 D-對羥基苯甲酸 E-異莨菪亭

課題組前期[49]采用薄層色譜法以咖啡酸為對照品，對厚藤進行定性鑒別，并采用高效液相色譜法檢測了厚藤提取物中咖啡酸、異槲皮苷、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 6個成分的含量，發現咖啡酸等酚酸類成分可作為厚藤的Q-Marker。本研究基于傳統功效-藥理活性-活性成分的思路，運用LC-Q-TOF-MS/MS技術，從“有效性”和“可測性”[50]確定厚藤治療AGA的Q-Marker，為進一步開展厚藤藥材質量標準、體內過程及作用機制研究提供思路和基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on Q-Marker for treating acute gouty arthritis withbased on serum pharmacochemistry

HOU Xiao-tao1, 2, WEI Yan-ting1, 2, XIA Zhong-shang2, 3, WEI Wei2, HAO Er-wei2, DU Zheng-cai2, ZHOU Yue-min1, DENG Jia-gang2

1. Faculty of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 3. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To study the therapeutic effect ofextract on acute gouty arthritis (AGA) rats and analyze the transitional components in blood of normal rats and AGA rats based on theory of quality marker (Q-Marker) of traditional Chinese medicine, and provide experimental basis for the determination of Q-Marker.AGA model was induced by sodium urate. The effect ofextract on joint swelling index, foot pad swelling and synovial tissue pathological changes in AGA rats were evaluated. The effect ofextract on interleukin-1β (IL-1β), macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α), and MIP-2 levels in serum of AGA rats were observed. LC-Q-TOF-MS/MS was used to qualitatively analyzeextract, and then the blood components of normal rats and AGA rats were identified after igextract.Compared with model group, joint swelling index and foot pad thickness of rats inextract group were significantly decreased (< 0.05, 0.01), IL-1β, MIP-1α, and MIP-2 levels in serum of high- and medium-doseextract groups were significantly decreased (< 0.05), infiltration of inflammatory cells in synovial tissue were reduced in high- and medium-doseextract groups. 53 components were identified fromextract, including resin glycosides, flavonoids, organic acids, coumarins, nucleosides, lignans, among which organic acids and flavonoids were the main components. Fragmentation rules of some compounds of resin glycosides, flavonoids, organic acids, and coumarins were also speculated. Four components including malic acid, caffeic acid, methyl caffeic acid and 4-hydroxybenzoic acid were identified in normal rat sample plasma. Four components including scopoletin, caffeic acid, methyl caffeic acid, and 4-hydroxybenzoic acid were identified in AGA rat sample plasma.extract can significantly relieve joint swelling of AGA rats, inhibit IL-1β, MIP-1α, and MIP-2 levels in serum, and inhibit inflammatory response. Main chemical components fromextract were rapidly identified as organic acids and flavonoids by using LC-Q-TOF-MS/MS. Scopoletin, caffeic acid, chlorogenic acid and its isomers (neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C) and protocatechuic acid were injected into the blood in form of prototype components or their metabolites in AGA rats, which could be used as Q-Marker for the treatment of AGA withextract.

(Linn.) Sweet; acute gouty arthritis; quality marker; LC-Q-TOF-MS/MS; scopoletin; caffeic acid; chlorogenic acid; neochlorogenic acid; cryptochlorogenic acid; isochlorogenic acid B; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid C; protocatechuic acid

R285.5；R285.61

A

0253 - 2670(2021)09 - 2638 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.015

2021-04-10

廣西中藥藥效研究重點實驗室運行補助項目（20-065-38）；廣西一流學科建設項目重點課題（2018XK043）；廣西中醫藥大學校級一般碩士研究生科研創新項目（YCSY2020026）；廣西中醫藥大學自治區級碩士研究生科研創新項目（YCSW2019170）；中國東盟傳統藥物研究國際合作聯合實驗室建設（二期）資助項目（桂科AD19110165）；農作物廢棄物功能成分研究協同創新中心資助項目（CICAR2020）；廣西中醫藥大學岐黃工程高層次人才團隊培育項目（2018006）

侯小濤（1969—），女，博士，教授，從事中藥活性成分及質量控制研究。Tel: 13878858205 E-mail: xthou@126.com

鄧家剛，教授。E-mail: dengjg53@126.com

[責任編輯 李亞楠]