蘆筍原液中蘋果酸單晶的提取與表征

崔晶晶，朱曉煊，黃展鵬，趙 琰

(河北科技師范學院化學工程學院，河北 秦皇島，066600)

蘆筍(Asparagus)口感爽滑[1]，且含有豐富的礦物質、氨基酸[2]、多糖[3]、甾體皂苷類[4]以及黃酮類等營養成分，近年來在食品和醫藥領域受到較大關注。例如：朱興磊等[5]以類似1型糖尿病的大鼠為研究對象，通過注射蘆筍老莖皂苷來研究其對血糖的影響，結果表明該皂苷能夠有效降低大鼠餐后血糖；何云山等[6]通過對比蘆筍與降脂理肝湯對高脂飲食小鼠腸道消化產生的影響，其結果顯示蘆筍汁的攝入能夠顯著降低腸道酶的活性。隨著蘆筍中越來越多的營養成分的發現，科研工作者們對于蘆筍提取的研究也取得了一定進展。崔守富等[7]通過超聲波-微波法從綠蘆筍莖中提取多糖，其中粗多糖提純率為4.23%；孟曉萌等[8]采用微波超聲協同萃取方法成功提取蘆筍廢棄物中的黃酮類物質，結果表明，其提取率可達0.4%。綜上，雖然目前提純分離方法有很多種，但由于天然產物成分的復雜性，通過傳統超聲萃取的方法，已經很難制備出純度較高的有效成分。因此探討蘆筍的高效分離方法變得尤為重要。

目前，結晶是常用的低能耗和高效的分離提純方法，由于其三維周期性結構特點，在成核及生長過程中，雜質分子一般較難嵌入到晶格結構當中，因此產物多具有高純度的特點，常應用在藥品、精細化工、食品添加劑和化肥等各個化工領域[9～12]。陸貽超等[13]采用重結晶法對2,5-呋喃二甲酸進行提純，通過調整不同比例的溶劑組成，培養相應單晶并解析其結構，結果表明采用N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺混合溶劑可使其純度提升為99.98%；李改真等[14]采用熔融結晶法對通過化學反應而制得的對苯二甲酰氯進行提純，其產物純度高達99.9%以上。綜上可知，結晶技術對于分離復雜的有機混合物，制取高純度的化合物具有重大作用。為此，筆者擬采用結晶法對蘆筍原液進行初分離。首先將蘆筍原液經過脫蛋白、醇沉、抽濾、再取濾渣經真空冷凍干燥得到高純度蘆筍多糖粉末，并在不同溶劑中配置成飽和溶液。然后采用單晶培養法培養出單晶晶體，并使用PXRD，SXRD和SEM對其進行表征，最后根據其空間結構數據進行晶習模擬。

1 試驗部分

1.1 藥品與儀器

試驗中使用的藥品及儀器詳情見表1和表2。

表1 從蘆筍原液中提取蘋果酸單晶的試驗用藥品

表2 從蘆筍原液中提取蘋果酸單晶的試驗用儀器

表3 從蘆筍原液中提取蘋果酸單晶的試驗條件

1.2 試驗方法

本次實驗采用溶劑揮發法和冷卻法進行單晶培養。首先將蘆筍原液預處理，獲得的蘆筍粗產品的多糖保留率為56%[15]。然后稱取過量的蘆筍多糖粉末，分別與不同溶劑進行混合(表3)，溫度控制在25～30 ℃，持續攪拌2～3 h，直至其達到平衡。之后取上層飽和清液，放置于樣品瓶中，一部分緩慢降溫至室溫后恒溫培養1～15 d，使其自發成核結晶，另一部分迅速移至4 ℃冰箱冷藏降溫培養1～15 d，使其冷卻結晶。每天進行1次觀察，直至樣品瓶底部有晶體出現，并對其進行單晶衍射分析和晶體結構解析。

1.3 表征方法

1.3.1PXRD分析采用日本理學D/Max-2500pc型X-射線衍射儀對樣品進行物相分析，以CuKα靶輻射為光源，管壓為40 KV，管流為200 mA，波長0.154 056 nm，2θ掃描范圍為10°～80°，掃描速度為8°/min，掃描步長為0.02°。

1.3.2SEM分析采用日立SU8010對晶體進行形貌分析，其操作電壓為15 kV和1 kV，并在氮氣保護的條件下間歇噴金。

1.3.3SXRD分析采用日本理學株式會社的X射線全面探測衍射儀Rapid-Rigaku II對樣品進行衍射分析，以MoKα靶射線進行掃描，掃描波長為7.103×10-8m，利用Rapid auto (Rigaku, 2004)收集衍射數據，并通過SHELXS-97和SHELXL-97程序進行結構解析和修正。

2 結果與討論

2.1 單晶培養結果

通過觀察記錄1～15號樣品保留1～15 d后發現，在以丙酮，氯仿，乙醇，丙酮-水(乙醇、氯仿)體系，氯仿-水體系，乙醇-氯仿體系為溶劑配制的飽和溶液中，由于溶液揮發過于迅速而且多糖溶解量較少等原因，未發現有晶體存在現象；在以乙醇-水體系為溶劑配制的混合溶液中，通過冷卻法出現少量細小晶體，而采用緩慢揮發法卻未出現明顯晶體(表3)。未產生單晶是由于多糖本身為混合物，其結晶反應與聚合物結晶類似，所以多糖分子未能通過分子有序運動達到大量出晶的條件；在純水配制的飽和溶液中，經過冷卻結晶后出現了形狀規則，大小適中的大顆粒晶體，但由于多糖粉末中含有較多雜質，因此無法判斷該單晶的分子式，需通過后續檢測與表征才能進一步確認其分子結構及晶體結構。

2.1 PXRD結果與分析

首先對多糖原料及所獲單晶進行衍射分析，結果表明，該衍射峰中存在生長較好的晶體，其衍射峰較為明顯(圖1)。除此之外，圖中的衍射基準線略有上升，因此可預測經過脫蛋白處理后的多糖粉末當中同時存在無定型粉末與晶體產品。為進一步確定該晶體產品的成分及其晶體結構，采用單晶培養的方法對該晶體進行成分及結構分析。單晶晶體的粉末衍射結果見圖2：其中(a)～(c)分別代表溶劑為純水，乙醇與水體積比為1∶1和1∶2。通過對比發現，從水溶液(圖2 (a))和乙醇水混合溶液(圖2 (b)和圖2 (c))中所得晶體的衍射峰位置和衍射峰強度基本一致，即它們的晶體結構相同，為同一種物質。但粉末衍射圖譜推導晶體結構存在一定的局限性，其無法準確判斷該晶體的空間構型及分子排布，因此需進一步分析其晶習晶型。

圖1 蘆筍多糖粉末的X-射線粉末衍射圖

圖2 單晶的X-射線粉末衍射圖：a-水, b-V(乙醇)∶V(水) =1∶1, c-V(乙醇)∶V(水) =1∶2

2.2 SEM形貌研究

圖3(a)為單晶的SEM圖，圖3(b)為單晶的局部放大圖。SEM結果表明，該單晶為塊狀結構，長徑比相對較大，晶面完整且各晶面相對平整；局部放大圖顯示，晶面存在部分缺陷，但未發現明顯的晶體錯位生長現象[16](圖3(b))。

圖3 待測晶體的SEM圖: (a)為單晶圖片, (b)為單晶的局部放大圖

2.3 單晶結構解析

通過分析SXRD所測定的單晶數據，并利用SHELXS-97和SHELXL-97程序進行該單晶晶胞結構解析及修正(表4)。結果表明，該物質的分子式是C4H8O6，為L-蘋果酸一水合物，屬于正交晶系，P212121空間群，相對分子量為152.10。其詳細晶胞參數為：a=0.558 13 (11)nm，b=0.981 9 (2)nm，c=1.179 4 (2)nm，α=90°，β=90°，γ=90°，晶胞體積V=0.646 3 (2) nm3，晶胞內分子數Z=4，即每個晶胞當中含有4個蘋果酸一水合物分子(圖4(b))。其中，2號位碳為手性碳，因此該晶體屬于由左旋蘋果酸分子結合形成的空間群(圖4(a))。

表4 單晶的晶體學數據和結構精修結果

依據單晶解析結果，可以獲得該單晶內部的分子連接形式(圖5)。單晶解析結果表明，蘋果酸一水合物單晶中的分子間通過O6—H6A…O1形成的氫鍵連接在一起或者通過弱H-H作用力(H1…H6A)和弱的相互作用力連接在一起(圖5(a))；另一個水分子與蘋果酸分子通過氫鍵O6—H6B…O3或者通過水分子中的氫鍵和弱H—H作用力(H3…H6B)連接成片(圖5(b))。片與片之間通過蘋果酸分子間氫鍵O5—H5…O2或者水和1個蘋果酸分子通過(O3—H3…H6B)連接在一起(圖5(c)，圖5(d))。蘋果酸分子同時作為溶劑分子的氫的供體和氫的受體，由此可見，在晶體結構形成過程中蘋果酸分子和水分子都發揮著重要的作用。

圖4 蘋果酸的分子結構圖(a)和晶胞結構圖(b)

圖5 蘋果酸單晶的晶體結構以及結構中的氫鍵

圖6 利用MS軟件模擬的單晶的晶體結構(a) BFDH模型, (b) AE模型

2.4 晶習預測

利用Materials Studio(MS)軟件中的Morphology模塊當中的AE模型和BFDH模型模擬晶體形貌，并與SEM圖進行對比。結果表明，通過BFDH模型模擬得到的晶習的晶面較多，與實際晶體形貌差異較大，其原因可歸結于BFDH模型忽略了分子間作用力和外部環境對于晶習的影響(圖6)。而AE模型充分考慮了晶體內部的結構單元以及其相互作用對晶習的影響，因此所獲得的結果與晶體SEM圖較為接近，其微小差異來源于未考慮溶劑分子對于晶習所產生的的影響。綜上，AE模型可以較好的預測L-蘋果酸—水合物的晶體形貌。

3 結 論

本次研究采用結晶技術和單晶培養方法從蘆筍原液中提取單晶并對其進行表征，得出以下結論：

(1)通過單晶培養法成功地從水及乙醇-水混合溶劑中獲得單晶，并經XRD證實所有單晶具有相同的衍射峰，為同一種物質；經SEM分析確定該晶體呈塊狀結構，晶面完整，無錯位生長現象。

(2)通過對該晶體進行單晶解析，確定其分子式為C4H8O6，為蘋果酸一水合物，屬于正交晶系，P212121空間群。該單晶的晶胞參數為：a=0.558 13(11) nm，b=0.981 9(2) nm，c=1.179 4(2) nm，α=90°，β=90°，γ=90°。每個晶胞中含有4個蘋果酸分子和4個水分子，分子之間通過氫鍵、弱H—H作用力和弱的相互作用力連接成片，片與片之間主要通過分子間氫鍵進行連接。因此，氫鍵在晶體結構形成的過程中發揮著重要的作用。

(3)通過AE模型和BFDH模型對晶習進行預測，結果表明，AE模型模擬的結果與掃描電鏡的結果吻合的較好。

本次試驗成功地從蘆筍原液中提取出L-蘋果酸單晶，其純度為100%。本次試驗結果表明，結晶方法在提純高純天然產物活性分子方面的具有應用價值。