miR-187通過靶向胰島素生長因子-1受體基因對人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

孫建立，馬志強

乳腺癌（breast cancer，BC）是全球女性面臨的最嚴重威脅之一，乳腺癌的發病率和死亡率分別高達24.2%和15%，在女性惡性腫瘤中排名第一。目前治療乳腺癌的主要方式是外科手術聯合放療及化療等綜合治療，但患者的預后仍較差。并且，乳腺癌發生和進展的分子機制尚不清楚，給診斷和治療帶來了巨大的挑戰。近年來，癌癥的分子標志已成為乳腺癌研究的重要影響因素。微小RNA（microRNA，miRNA）被認為是一類新的內源性分子，是非蛋白質編碼的小RNA分子，可通過直接切割靶mRNA或通過抑制其翻譯來負調節轉錄后基因的表達。研究發現，異常的miRNA表達與各種人類癌癥如乳腺癌、結腸癌和肺癌等腫瘤的發生和發展有關。已有研究證實，miR-187在肺癌、胃癌、卵巢癌等中異常表達，參與腫瘤的進展，與患者預后及總體生存率密切相關。近期報道顯示，miR-187在乳腺癌中表達下調，但關于其在乳腺癌中的作用尚不清楚。胰島素生長因子-1受體（insulinlike growth factor-1 receptor，IGF-1R）基因與多種惡性腫瘤進展有關，有研究顯示，其可促進腫瘤細胞增殖、分化、周期進程還可抑制細胞凋亡。楊曉民等人發現，IGF-1R基因可促進乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和遷移。近期Han等研究發現，miR-187通過靶向肝細胞癌中的IGF-1R抑制腫瘤生長和轉移。提示miR-187可能通過靶向IGF-1R在乳腺癌中發揮作用。因此，本研究旨在探究miR-187靶向IGF-1R調控乳腺癌細胞增殖和凋亡的分子機制，以期為乳腺癌的靶向治療提供分子標志。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常乳腺上皮細胞株HBL-100及人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3（美國ATCC細胞庫）；DMEM培養基（美國Hyclone公司）；青霉素-鏈霉素、胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司）；RNA提取試劑盒、脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；miR-187 mimics及對照mimics-NC（上海吉瑪制藥技術有限公司）；逆轉錄試劑盒、qRT-PCR檢測試劑盒（日本TaKaRa公司）；MTT試劑（美國Sigma公司）；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Pro‐mega公司）；細胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學發光試劑盒（碧云天生物技術研究所）；PCNA抗體、Cleaved Caspase-3抗體、IGF-1R抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Abcam公司）。

1.2 細胞培養

常規復蘇人正常乳腺上皮細胞HBL-100和人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3，分別采用含10%胎牛血清的DMEM培養基（含1%青霉素-鏈霉素雙抗）培養，并放置在體積分數5%二氧化碳、37℃培養箱中培養。每天觀察細胞生長狀態，及時更換新鮮培養基，收集處于對數增殖期的細胞進行后續實驗。

1.3 細胞轉染和分組

將對數生長期的乳腺癌MDA-MB-231細胞以胰酶消化，計數后接種到6孔板中，接種密度為2×10個/孔，于37℃繼續培養，待細胞貼壁生長匯合度達60%時，利用Lipofectamine 2000轉染試劑分別將miR-187 mimics、陰性對照mimics-NC轉染至MDA-MB-231細胞，分別記為miR-187組和miR-NC組，同時設置未轉染的MDAMB-231細胞為空白對照組。每組設置3個復孔，各組細胞在37℃培養箱中常規培養48 h，收集細胞測定相應指標。

1.4 qRT-PCR檢測細胞中miR-187的相對表達水平

分別收集處于對數生長期的HBL-100、MDAMB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3細胞以及轉染48 h后各組MDA-MB-231細胞，分別參照RNA提取試劑盒說明書提取細胞中總RNA，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，并以cDNA為模板，以U6為內參，使用qRT-PCR檢測試劑盒進行PCR擴增。反應條件為：94℃4 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃20 s，共設40個循環。采用2法計算各細胞中miR-187相對表達水平。所用引物如下：

U6-F 5，-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，U6-R 5，-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。miR-187-F 5，-TCGTGGGTCGTGTCTTGTGTTGC-3’，miR-187-R 5，-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.5 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測

分別收集轉染48 h后各組MDA-MB-231細胞，加入適量細胞裂解液，在冰上提取總蛋白，以BCA法檢測蛋白濃度，取等量蛋白樣品行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，設置電壓為110 V，蛋白分離后電轉至PVDF膜上，將膜放置在含5%脫脂奶粉中封閉1 h，再分別加入PCNA一抗（1∶800稀釋），Cleaved Caspase-3一抗（1∶800稀釋），IGF-1R一抗（1∶800稀釋），4℃過夜孵育，TBST洗膜后再加入二抗（1∶3 000稀釋），室溫下孵育2 h。TBST洗膜后，采用ECL化學發光，顯色，轉移至暗室，使用凝膠成像系統成像拍照，以GAPDH為內參，使用Image J軟件分析各條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達水平。

1.6 MTT法檢測細胞增殖能力

轉染48 h后分別向各組MDA-MB-231細胞加入MTT溶液10μL，在37℃繼續孵育4 h，取出培養板，去上清，再向每孔細胞中加入150μL二甲基亞砜，避光振蕩反應10 min，待沉淀完全溶解后，使用酶標儀上檢測細胞光密度值（OD值），波長為450 nm。實驗重復3次。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

采用0.25%胰蛋白酶消化轉染后48 h各組MDA-MB-231細胞，離心收集細胞，加入100μL Binding buffer結合緩沖液，重懸細胞并制成1×10個/毫升的細胞懸液，向100μL細胞懸液中加入Annexin V-FITC 5μL，混勻后孵育15 min，再向細胞懸液中加入PI染液5μL，避光孵育15 min，立即上流式細胞儀檢測，實驗重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

TargetScan等在線數據庫預測發現miR-187與IGF-1R 3’-UTR存在靶向結合位點，提示IGF-1R可能是miR-187的直接靶基因。根據生物信息學預測結果分別擴增與miR-187結合的IGF-1R 3’-UTR序列及突變序列，即IGF-1R-Wt和IGF-1R-Mut，分別構建到熒光素酶報告載體上，該部分實驗由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。將構建好的重組載體質粒分別與miR-187 mim‐ic及對照mimics-NC共轉染MDA-MB-231細胞，48 h后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別測定海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，計算相對熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.9 統計學方法

使用SPSS21.0軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析比較多組間差異，采用SNK-q檢驗分析比較兩兩組間差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-187在乳腺癌細胞中呈低表達

qRT-PCR檢測結果顯示，與人正常乳腺上皮細胞HBL-100（1.00±0.10）相比，乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3細 胞miR-187的 表 達 水 平［（0.11±0.01）、（0.26±0.02）、（0.42±0.04）、（0.34±0.03）］均顯著下調（F=133.939，P＜0.05）。乳腺癌MDA-MB-231細胞中miR-187的表達水平最低，后續選取MDA-MB-231細胞用于轉染實驗。

2.2 轉染miR-187 mimics對在MDA-MB-231細胞中miR-187和IGF-1R表達的影響

qRT-PCR檢測結果顯示，與miR-NC組和空白對照組相比，轉染miR-187 mimics后MDA-MB-231細胞中miR-187的表達水平顯著上調（t=22.293，22.497，均P＜0.01）。Western blotting檢測結果顯示，與miR-NC組和空白對照組相比，miR-187組MDA-MB-231細胞中IGF-1R蛋白表達水平明顯下調（t=15.173，16.016，，均P＜0.01）。見圖1和表1。

圖1 Western blotting檢測各組MDA-MB-231細胞中IGF-1R蛋白表達水平

表1 轉染miR-187 mimics對MDA-MB-231細胞中miR-187和IGF-1R蛋白表達水平的影響/±s

2.3 過表達miR-187對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響

MTT實驗檢測結果顯示，與miR-NC組和空白對照組相比，miR-187組MDA-MB-231細胞OD值 顯 著 降 低（t=11.941，11.023，均P＜0.01）。Western blotting檢測結果顯示，與miR-NC組和空白對照組相比，miR-187組MDA-MB-231細胞中PCNA蛋白表達水平明顯下調（t=12.247，11.635，均P＜0.01）。見圖2和表2。

圖2 Western blotting檢測各組MDA-MB-231細胞中PCNA蛋白表達水平

表2 過表達miR-187對MDA-MB-231細胞OD值及PCNA蛋白表達的影響/±s

2.4 過表達miR-187對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，與miR-NC組和空白對照組相比，miR-187組MDA-MB-231細胞凋亡率明顯升高（t=15.414，15.013，均P＜0.01）。West‐ern blotting檢測結果顯示，與miR-NC組和空白對照組相比，miR-187組MDA-MB-231細胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達水平明顯上調（t=24.333，23.847，均P＜0.01）。見圖3和表3。

A

2.5 miR-187對IGF-1R靶向調控關系驗證

Tar‐getScan等生物信息學軟件預測結果顯示，miR-187與IGF-1R基因3’UTR存在靶向結合位點，如圖4所示。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-187能夠抑制野生型IGF-1R-Wt的相對熒光素酶活性（t=12.277，P=0.0003），而對突變型IGF-1R-Mut的相對熒光素酶活性無影響（t=0.408，P=0.704）。

表3 過表達miR-187對MDA-MB-231細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平的影響/±s

3 討論

乳腺癌是女性癌癥相關死亡率的主要原因，雖然乳腺癌的診斷和系統治療方法已經取得進展，但患者的預后仍然很差。近年來，大量研究報道miRNA在癌癥中表達失調，參與腫瘤的發展。基于miRNA數據和疾病的組織特異性，Liang等提出了一種名為miTS的新方法來預測乳腺癌的潛在治療方法，表明miRNA在乳腺癌中起著至關重要的作用。證據表明，miR-187在人類多種惡性腫瘤中異常表達，且通過靶向不同基因參與腫瘤細胞生物學行為的調控。如Lin等研究，miR-187在宮頸癌組織和細胞系中表達下調，過表達miR-187可通過靶向HPV16 E6抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。在骨肉瘤中，miR-187在骨肉瘤臨床組織樣本及骨肉瘤細胞中的表達水平顯著降低，上調miR-187可通過靶向MAPK12在體外抑制細胞生長和侵襲。另外有研究顯示miR-187可發揮致癌基因的作用，如在非小細胞肺癌中，miR-187在非小細胞肺癌組織和細胞中表達上調，且其可通過靶向PTRF促進細胞上皮間質轉化和遷移。Li等實驗發現，miR-187在胃癌中呈高表達，體內和體外實驗均證實了miR-187可通過抑制FOXA2促進胃癌的生長和轉移。本實驗結果顯示，miR-187在乳腺癌細胞中呈低表達，提示其可能具有抑制乳腺癌發生和進展的作用。這與以往關于miR-187發揮抑癌基因作用的研究類似。

為進一步探究miR-187在乳腺癌中的作用，本實驗選擇miR-187表達水平最低的乳腺癌MDA-MB-231細胞轉染miR-187 mimics，以探究過表達miR-187對MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響。qRT-PCR檢測結果顯示，轉染miR-187 mimics能夠顯著上調MDA-MB-231細胞中miR-187的表達。MTT實驗表明，過表達miR-187可抑制MDA-MB-231細胞增殖能力。PCNA目前已被廣泛認為是腫瘤細胞處于增殖狀態的分子指標。本實驗West‐ern blot實驗結果顯示，增殖細胞核抗原PCNA的表達水平明顯降低。因此進一步證實了過表達miR-187可抑制MDA-MB-231細胞增殖。流式細胞術和Western blot檢測結果顯示，過表達miR-187能夠提高細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表達水平，表明過表達miR-187可促進乳腺癌細胞凋亡。此外，本實驗發現，過表達miR-187后IGF-1R蛋白表達水平明顯下降，提示miR-187參與調控乳腺癌細胞增殖和凋亡可能與抑制IGF-1R的表達有關。IGF-1R基因編碼的蛋白是一種酪氨酸蛋白受體，在細胞轉化、凋亡及有絲分裂等細胞生物學行為中發揮重要作用。最近研究顯示，IGF-1R與乳腺癌中呈高表達，且與乳腺癌細胞增殖、凋亡等密切相關。本實驗通過生物信息學及雙熒光素酶報告基因驗證了IGF-1R是miR-187的靶基因。表明過表達miR-187可通過靶向調控IGF-1R的表達抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，促進細胞凋亡。

注：1—GAPDH;2—Cleaved Caspase-3;3—對照組；4—miR-NC;5—miR-187。

圖4 miR-187與IGF-1R基因3’UTR存在靶向結合位點示意圖

綜上，本研究結果表明miR-187在乳腺癌細胞中呈低表達，且過表達miR-187可抑制乳腺癌MDAMB-231細胞增殖，促進細胞凋亡，該過程與靶向調控IGF-1R基因有關。miR-187和IGF-1R可能作為乳腺癌基因治療的新靶點。