淺析食品檢測實驗室菌株的管理和使用

解曉霜

摘 ?要：菌株是食品檢測微生物實驗室檢驗工作中不可缺少的重要生物資源，常用于培養基的驗收、試驗對照、人員培訓考核、方法確認等方面的質量控制。因此為了確保工作菌株的生物特性和純度、實現工作菌株方便快捷地使用和溯源 ，菌株的相關管理工作在微生物實驗室就顯得尤為重要，按統一操作程序制備的菌株是微生物試驗結果一致性的重要保證。本文簡要闡述了食品檢測微生物室在檢驗工作中對菌株管理和使用的方法。

關鍵詞：菌株;管理;使用;方法

1前言

CNAS-CL01-A001-2018《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》中明確要求：實驗室必須保存有滿足試驗需要的標準菌種/菌株（標準培養物），除檢測方法中規定的菌種外，還應包括應用于培養基（試劑）驗收/質量控制、方法確認/證實、陽性對照、陰性對照、人員培訓考核和結果質量的保證等所需的菌株。故菌株的規范管理和使用直接關系到食品微生物檢測的質量，以下將從實際工作中闡述菌株的管理和使用流程和方法。

2標準菌株的獲取

標準菌株應來自認可的國內或國外菌種保藏機構。如：中國醫學細菌保藏管理中心（CMCC）、美國標準菌種保藏中心（ATCC）。菌株購買前需根據實驗室檢測需求制定采購計劃，經審批后，向認可的國內或國外的菌種保藏機構購買標準菌株。標準菌株到達實驗室后，菌種管理人應檢查其名稱、數量以及每一支的完整性，同時將菌種的所有信息填寫記錄（包括菌種名稱、編號、數量、代數、來源、接收日期、接收人等），并將其貯存在規定溫度的冰箱里，首次購買的菌株凍干粉一般保存在2～8℃冰箱中。

3標準菌株的復蘇、復壯和保存

標準菌株的復蘇、復壯或培養物的制備應按供應商提供的說明或按已驗證的方法進行。復蘇、復壯應選擇營養成分豐富且全面的培養基（例如：TSA/TSB/NA/NB/SDB/SDA等），一般不使用選擇性較強的培養基;特殊的一些菌株在普通的培養基上生長不好，可能還需添加生長因子。

標準儲備菌株復蘇后應先進行純度和特性確認。純度確認包括：平板劃線查看菌落形態、革蘭氏染色、顯微鏡觀察菌體形態等;關鍵特性確認可選擇：特征生化反應確認、試劑盒鑒定、菌種鑒定儀鑒定等。需要注意的是，從開啟、復蘇、復壯到純度和特性的確認，都應做好實驗記錄。

標準儲備菌株保藏的方法有很多，包括定期移植法、液體石蠟法、磁珠保藏法、冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏、-80℃低溫保藏法，食品檢測微生物室一般采用比較多的是磁珠保藏法，并置于-80℃條件下，可以實現長期保存的目的，一般保存周期可達10年。方法是取適量復蘇經過確認的菌懸液置于磁珠管中，加蓋充分搖晃，使菌株吸附于磁珠中，再將管中菌液吸出，加蓋并貼上含菌株信息的標簽，迅速置于-80℃冰箱保存。菌種應設專人管理，菌種保藏的地點應采取一定的措施使非管理者不能輕易獲取，例如加鎖保管，雙人保管等。

標準儲備菌株可用于制備每月或每周1次轉種的工作菌株。每次使用時取一顆磁珠置于復蘇液培養即可，并做好記錄。注意取完磁珠盡量在最短時間內將剩余磁珠放回-80℃冰箱中，以防長時間的溫度變化對菌株造成傷害。從保藏機構獲取的凍干菌種為0代菌種，每轉接一次增加一代（1代是指將活的培養物接種到微生物生長的新鮮培養基中培養，任何形式的轉種均被認為傳代一次），工作菌株的傳代次數應嚴格控制，不得超過5代，以防止過度的傳代增加菌株變異的風險。

4標準菌株的衰退和銷毀

菌種在培養或保藏過程中，由于自發突變的存在，出現某些原有優良生產性狀的劣化、遺傳標記的丟失等現象，稱為菌種衰退。菌種衰退不是突然發生的，而是從量變到質變的逐步演變過程。菌種衰退的主要原因是有關基因的負突變。合理的育種、選用合適的培養基、創造良好的培養條件、采用有效的菌種保藏方法等可以有效的防止菌種的退化。

菌種衰退不是突然發生的，而是從量變到質變的逐步演變過程。開始時，在群體細胞中僅有個別細胞發生自發突變（一般均為負變），不會使群體菌株性能發生改變。經過連續傳代，群體中的負變個體達到一定數量，發展成為優勢群體，從而使整個群體表現為嚴重的衰退。

菌種衰退的主要原因是有關基因的負突變。如果控制產量的基因發生負突變，則表現為產量下降;如果控制孢子生成的基因發生負突變，則產生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過程中會發生自發突變。雖然自發突變的幾率很低（一般為10-6～10-9），尤其是對于某一特定基因來說，突變頻率更低。但是由于微生物具有極高的代謝繁殖能力，隨著傳代次數增加，衰退細胞的數目就會不斷增加，在數量上逐漸占優勢，最終成為一株衰退了的菌株。造成菌株衰退的原因還包括了表型延遲、質粒脫落、連續傳代、不適宜的培養和保藏條件等。

若標準菌株如果經過確認試驗證明已經老化、退化、變異、污染等或該菌株已無使用需要時，應及時滅菌銷毀并做好記錄。

5菌株保藏的基本原則

微生物菌種的操作需符合《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《人間傳染的病原微生物》和《動物病原微生物分類名錄》以及GB 19486的有關要求。此外針對微生物菌種的特性選擇適宜的保藏方法，以保持菌種自身性狀的穩定。另外微生物菌種的保藏工作不能對周圍的環境造成污染和傷害。

6總結

菌種每次轉種傳代，必須做純度、特性等實驗室所需關鍵指標的確認，實驗室應建立菌種管理（從標準菌株到工作菌株）的文件和記錄，內容包括菌株的申購、進出、收集、貯藏、確認、轉種、使用以及銷毀等全過程。每支菌種都應注明其名稱、標準號、接種日期、傳代數，并記錄菌種生長的培養基和培養條件、菌種保藏的位置和條件等信息，同時全過程要保證生物安全。

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