基于酵母表面展示技術(shù)的耐熱木聚糖酶全細胞催化劑的構(gòu)建及酶學(xué)性質(zhì)研究

鄧香連，劉清怡，熊海容，張 莉

（中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074）

木聚糖酶（Xylanase）是可將木聚糖降解為低聚木糖和少量木糖的一類酶，主要包括內(nèi)切木聚糖酶、外切木聚糖酶和木糖苷酶，其中內(nèi)切木聚糖酶能水解木聚糖主鏈中的β-1，4糖苷鍵生成木二糖、木三糖等寡糖，是降解木聚糖最主要的酶［1，2］。木聚糖酶來源廣泛，可從動物、植物或微生物中獲得，目前研究較多的是來源于細菌或真菌的木聚糖酶［3］。已有多種不同來源的木聚糖酶在多個宿主中成功進行了異源表達，如大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、畢赤酵母等，不同程度地提高了木聚糖酶的表達量［4，5］。

木聚糖酶是一種重要的工業(yè)酶制劑，在飼料、造紙、食品、紡織等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［6］。但在具體應(yīng)用過程中環(huán)境條件要求較苛刻，如飼料生產(chǎn)制粒工藝中的調(diào)質(zhì)、制粒等過程需要70℃以上的高溫處理，使添加的酶活性損失很大，降低了使用效率［7］；麻類紡織中苧麻脫膠、造紙中紙漿溶解和漂白等工藝需要強酸、強堿等處理，也會使酶的活性大大降低［8］，因此提高酶在高溫、酸性、堿性、含有機溶劑等條件下的穩(wěn)定性受到越來越多的關(guān)注。

微生物表面展示技術(shù)近年來發(fā)展迅速且應(yīng)用廣泛，利用微生物細胞展示酶作為催化劑（也稱全細胞催化劑）不僅具有固定化酶的特性，且可省去繁瑣的分離純化操作，制備方法簡單，易于回收和再生利用［9］。多項研究顯示全細胞催化劑較游離酶表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，Yuzbasheva等［10］在解脂耶氏酵母中獲得脂肪酶Lip2p的全細胞催化劑，在50℃處理5 h后殘留約83%的酶活力，而游離酶在50℃處理1 h酶活力幾乎降為零，此外將全細胞催化劑和游離酶用EDTA、SDS、DMSO等試劑處理24 h，全細胞催化劑殘余的酶活力均高于游離酶；Wang等［11］在釀酒酵母中展示表達葡萄糖氧化酶GOx，發(fā)現(xiàn)GOx全細胞催化劑較游離酶在30～60℃具有更好的熱穩(wěn)定性。

本研究利用酵母表面展示技術(shù)將實驗室前期篩選獲得的耐熱木聚糖酶DSB［12］展示表達在畢赤酵母細胞表面獲得DSB全細胞催化劑，并對全細胞催化劑和游離酶的酶學(xué)性質(zhì)進行比較分析，為DSB全細胞催化劑的工業(yè)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，也為獲得穩(wěn)定性更好的酶制劑提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒含木聚糖酶DSB基因的重組質(zhì)粒pPICZαA/DSB由實驗室構(gòu)建并保藏。克隆宿主大腸桿菌Top10、表達宿主巴斯德畢赤酵母X33均由實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑PrimeSTAR Max DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker等購于大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等購于上海Axy?Prep公司；底物木聚糖為實驗室自提樺木木聚糖［13］；Tryptone和Yeast Extract購于Oxoid公司；山梨醇、瓊脂、無氨基酵母氮源YNB、生物素均購于Biosharp公司；DSB游離酶由實驗室制備；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基LB、大腸桿菌抗性篩選平板低鹽LB（含抗生素Zeocin，終濃度25μg/mL）、畢赤酵母培養(yǎng)基YPD、畢赤酵母抗性篩選平板YPDSZ（含抗生素Zeocin，終濃度100μg/mL）、畢赤酵母生長/誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY/BMMY等配方見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。

1.2 方法

1.2.1 展示表達DSB重組質(zhì)粒的構(gòu)建以畢赤酵母細胞壁蛋白Gcw61（Accession in NCBI XP_002 494332）［14］為錨定蛋白，去除自身信號肽后設(shè)計引物（表1），并在5'端和3'端分別引入KpnⅠ和NotⅠ位點（下劃線標記）。以畢赤酵母X33基因組為模板進行PCR擴增，對獲得的GCW61基因片段與質(zhì)粒pPICZαA/DSB同時進行雙酶切，然后進行連接、轉(zhuǎn)化和篩選后獲得展示表達DSB重組質(zhì)粒pPICZαA/DSB-GCW61，并送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進行測序驗證。

表1 PCR擴增引物序列

1.2.2 展示表達DSB重組菌的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達對pPICZαA/DSB-GCW61使用SacI進行線性化，然后采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌畢赤酵母X33感受態(tài)細胞，涂布于YPDSZ抗性篩選平板上，于28℃培養(yǎng)2～3 d，使用AOX1通用引物對轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR鑒定獲得展示表達DSB重組菌X33/DSB-GCW61。將該重組菌接種于BMGY培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min過夜培養(yǎng)至OD600達2～6，取適量菌體重懸于BMMY培養(yǎng)基中，控制起始OD600約為1，28℃、250 r/min連續(xù)發(fā)酵168 h，每隔24 h取樣，并補加1%的甲醇。以畢赤酵母X33作為陰性對照，所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.3 重組菌的免疫熒光顯微鏡分析發(fā)酵結(jié)束后取1 mL菌懸液，離心去除上清，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）洗滌菌體3次，重懸至含10 mg/mL BSA的PBS中，調(diào)整樣品OD600值約為5。取200μL樣品加入鼠源抗6×His標簽單抗（1∶200稀釋），室溫下低速振蕩孵育2 h。孵育結(jié)束后用PBS洗3次，重懸至含10 mg/mL BSA的PBS中，加入Alexa Flour 488標記羊抗鼠IgG抗體（1∶200稀釋）于避光處室溫低速振蕩孵育1 h。孵育結(jié)束后用PBS洗3次，使用激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長為488 nm，以畢赤酵母X33細胞作為陰性對照。

1.2.4 重組菌展示表達DSB酶活力的測定對X33/DSB-GCW61進行誘導(dǎo)表達，每隔24 h取樣后離心去除上清，用50 mmol/L pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液洗滌菌體3次，然后用等量緩沖溶液重懸后獲得DSB全細胞催化劑樣品。以0.5%木聚糖為底物，采用DNS法［15］測定酶活力，同時測定菌懸液的OD600值，根據(jù)1OD600=0.245 g/L［9］計算出最終酶活力。酶活力單位定義為在最適溫度和pH條件下，1 min內(nèi)水解0.5%木聚糖底物產(chǎn)生1μmol木糖所需要的全細胞催化劑的量。以畢赤酵母X33細胞作為對照，所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.5 DSB全細胞催化劑和游離酶的酶學(xué)性質(zhì)比較分析

1）溫度對全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。在pH 6.5條件下，分別在40、50、60、65、70、75、80℃測定全細胞催化劑和游離酶的酶活力，設(shè)2種酶的最高酶活力為100%，計算不同溫度條件下2種酶的相對酶活力。取用pH 6.5檸檬酸緩沖液適當稀釋后的2種酶置于70℃水浴處理2.5 h，每隔30 min測定2種酶的酶活力，設(shè)未處理的2種酶的酶活力為100%，計算在70℃條件下處理不同時間2種酶的殘余酶活力。

2）pH對全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。分別配制pH 4.0～8.0 50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液體系，以上述緩沖液分別配制0.5%的木聚糖底物，且以對應(yīng)pH緩沖液稀釋2種酶，分別使用上述底物測定2種酶的酶活力，反應(yīng)溫度均為65℃，設(shè)2種酶的最高酶活力為100%，計算不同pH條件下2種酶的相對酶活力。分別用pH 3.0和pH 6.0的緩沖液適當稀釋2種酶后，放置40℃水浴處理2.5 h，每隔30 min分別測定2種酶的酶活力，設(shè)未處理的2種酶的酶活力為100%，計算不同pH條件下處理不同時間2種酶的殘余酶活力。

3）高濃度鹽對全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。在2種酶的酶活反應(yīng)體系中分別加入1%、3%、5%、10%、15%的NaCl或KCl，然后在65℃、pH 6.5條件下測定2種酶的酶活力，以不加鹽的2種酶的酶活力為100%，計算不同鹽濃度條件下2種酶的相對酶活力。

4）有機溶劑對DSB全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。分別配制0～30 %的甲醇、乙醇、正丁醇、丙三醇溶液，用上述不同濃度的有機試劑稀釋2種酶并在室溫孵育30 min后，在65℃、pH 6.5條件下測定2種酶的酶活力，設(shè)未用有機試劑處理的2種酶的酶活力為100%，計算不同濃度有機試劑處理后2種酶的相對酶活力。

5）金屬離子和化學(xué)試劑對DSB全細胞催化劑和游離酶酶活力的影響。在2種酶的酶活反應(yīng)體系中加入適量不同金屬離子和化學(xué)試劑溶液，使其終濃度為1.0 mmol/L，然后在65℃、pH 6.5條件下測定2種酶的酶活力，設(shè)未做處理的2種酶的酶活力為100%，計算不同金屬離子和化學(xué)試劑處理后2種酶的相對酶活力。以上所有試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 展示表達DSB重組菌的構(gòu)建

以畢赤酵母X33基因組為模板，用引物P1/P2進行PCR擴增獲得錨定蛋白Gcw61的基因片段（144 bp），將其與質(zhì)粒pPICZαA/DSB同時使用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切，然后進行連接、轉(zhuǎn)化和篩選后獲得展示表達DSB的重組質(zhì)粒pPICZαA/DSB-GCW61，經(jīng)武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序驗證載體構(gòu)建成功（圖1）。隨后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33，篩選獲得展示表達DSB的重組菌X33/DSB-GCW61。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZαA/DSB-GCW61

2.2 重組菌熒光的觀察

木聚糖酶DSB的N端帶有6×His標簽，取誘導(dǎo)表達168 h的重組菌使用抗體處理后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（激發(fā)波長488 nm），結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，重組菌細胞發(fā)出綠色熒光，表明錨定蛋白Gcw61成功將DSB展示表達在畢赤酵母細胞表面。

2.3 展示表達DSB重組菌的酶活分析

對重組菌X33/DSB-GCW61在搖瓶水平誘導(dǎo)表達168 h，每隔24 h取樣，檢測木聚糖酶全細胞催化劑的酶活力，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，DSB全細胞催化劑的酶活力會持續(xù)增長，且在72～144 h增長較快，144 h后酶活力趨于穩(wěn)定，168 h時酶活力最大，達13 510 U/g。

2.4 DSB全細胞催化劑與游離酶酶學(xué)性質(zhì)的比較分析

圖2 重組菌的熒光顯微鏡觀察

2.4.1 溫度對2種酶酶活力的影響測定不同溫度下DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的酶活力，從圖4（A）可以看出，2種酶的最適反應(yīng)溫度均為65℃，屬于高溫酶，且2種酶在50～75℃都能保持50%以上的相對酶活力，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力均高于DSB游離酶。將2種酶在70℃條件下保溫處理，監(jiān)測2種酶酶活力的變化，圖4（B）的結(jié)果顯示隨著處理時間的增加，2種酶的酶活力均逐漸降低，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力始終顯著高于DSB游離酶，在處理120 min時，DSB全細胞催化劑的相對酶活力為50%，而DSB游離酶的相對酶活力已降至30%。工業(yè)應(yīng)用中很多工藝需高溫處理，如飼料加工制粒過程溫度會高達70℃以上，DSB全細胞催化劑比DSB游離酶具有更好的耐熱性，這一特性使其在飼料行業(yè)具有較好的應(yīng)用前景。

圖3 2株菌的酶活曲線

2.4.2 pH對2種酶酶活力的影響測定不用pH條件下DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的酶活力，結(jié)果見圖5（A），2種酶的最適反應(yīng)pH均為6.5，在pH 5.0～7.5均可保持60%以上的相對酶活力，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力略高于DSB游離酶。將2種酶在pH 3.0和pH 6.0酸性條件下處理，監(jiān)測2種酶酶活力的變化，從圖5（B）可以看出，在pH 6.0、40℃條件下處理150 min，DSB全細胞催化劑的酶活力無明顯下降，而DSB游離酶的酶活力下降約7%；而在pH 3.0、40℃條件下處理90 min，2種酶可以保持80%以上的相對酶活力，處理150 min也可保持60%以上的相對酶活力，DSB全細胞催化劑的相對酶活力均略高于DSB游離酶。表明DSB全細胞催化劑比DSB游離酶在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定，適用于工業(yè)應(yīng)用中的酸性環(huán)境。

圖4 DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的最適反應(yīng)溫度（A）及熱穩(wěn)定性（B）

圖5 DSB全細胞催化劑和游離酶的最適pH（A）及pH穩(wěn)定性（B）

2.4.3 不同濃度NaCl和KCl對2種酶酶活力的影響在含不同濃度NaCl或KCl條件下分別測定2種酶的酶活力，從圖6（A）可以看出，當NaCl濃度在1%～5%時2種酶的酶活力均略有提高，當NaCl濃度高達10%和15%時，2種酶仍能維持80%以上的相對酶活力，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力略高于DSB游離酶。而1%～15%的KCl對2種酶的酶活均有不同程度的促進作用，當KCl濃度為3%時DSB全細胞催化劑和DSB游離酶酶活力提高最多，分別達115%和113%。結(jié)果表明，DSB全細胞催化劑和DSB游離酶在高濃度鹽溶液中均能保持較高的酶活力，且DSB全細胞催化劑的耐鹽性更強，因此適用于工業(yè)中高鹽的環(huán)境。

2.4.4 有機溶劑對2種酶酶活力的影響4種常見有機溶劑對2種酶酶活力的影響見圖7。圖7（A）顯示5%～15%的甲醇對DSB全細胞催化劑的酶活力有顯著的促進作用，其中5%甲醇處理后DSB全細胞催化劑的相對酶活力增加幅度最大，達138%，且30%甲醇處理后DSB全細胞催化劑仍能維持94%的相對酶活力；而DSB游離酶的酶活力隨著甲醇體積分數(shù)的增加呈緩慢下降趨勢，30%甲醇處理后DSB游離酶殘余87%的相對酶活力。乙醇對2種酶酶活力的影響結(jié)果如圖7（B）所示，隨著乙醇體積分數(shù)的提高，2種酶的酶活力均緩慢降低，30%乙醇處理后2種酶均能維持75%以上的相對酶活力，但DSB全細胞催化劑的相對酶活力均略低于DSB游離酶。圖7（C）的結(jié)果顯示，5%丙三醇處理后DSB游離酶的相對酶活力增加至106%，隨后隨著丙三醇體積分數(shù)的提高其相對酶活力逐漸降低，30%丙三醇處理后殘留約60%的相對酶活力，而DSB全細胞催化劑隨著丙三醇體積分數(shù)的增加相對酶活力逐漸降低，且降低趨勢與游離酶基本一致。正丁醇對2種酶酶活力的影響見圖7（D），5%正丁醇處理后DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的酶活力分別提高至122%和110%，隨后隨著正丁醇體積分數(shù)的提高2種酶的酶活力略微降低，30%正丁醇處理后2種酶均能保留90%以上的相對酶活力。

圖6 不同濃度NaCl和KCl對2種酶酶活力的影響

圖7 不同濃度有機溶劑對2種酶酶活力的影響

2.4.5 金屬離子和化學(xué)試劑對2種酶酶活力的影響不同金屬離子和化學(xué)試劑對2種酶酶活力的影響見表2。Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ni2+對2種酶酶活力均有不同程度的促進作用，且除Mg2+、K+外，其他金屬離子存在時DSB全細胞催化劑酶活力的提高幅度均高于DSB游離酶；Zn2+對DSB游離酶酶活力有輕微的抑制作用，而對DSB全細胞催化劑酶活卻有顯著的促進作用，其相對酶活力提高至120.05%；Mn2+、Pb2+、Fe3+、SDS、EDTA對2種酶酶活力均有不同程度的抑制作用，且同種金屬離子或化學(xué)試劑導(dǎo)致2種酶酶活力的下降幅度無顯著差別；Cu2+對2種酶酶活力均有顯著的抑制作用，DSB全細胞催化劑和DSB游離酶的酶活力分別下降至38.84%和52.79%；Li+、Co2+對2種酶酶活力無明顯影響。表明DSB全細胞催化劑和DSB游離酶對大部分金屬離子和化學(xué)試劑有一定耐受性，且DSB全細胞催化劑的耐受性優(yōu)于DSB游離酶。

表2 不同金屬離子和化學(xué)試劑對2種酶酶活力的影響（單位：%）

3 小結(jié)與討論

目前已有多種不同來源的木聚糖酶在大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌等多個宿主中成功進行異源表達［16-18］，但大部分均為分泌表達，需進行繁瑣的分離和純化后才能進行應(yīng)用。利用微生物表面展示技術(shù)將酶展示表達在微生物細胞表面獲得全細胞催化劑，可省去繁瑣的分離純化步驟，制備方法簡單［19］。本研究利用畢赤酵母表面展示技術(shù)，以細胞壁蛋白Gcw61為錨定蛋白，將實驗室前期篩選獲得的耐熱木聚糖酶DSB進行展示表達，搖瓶發(fā)酵獲得的DSB全細胞催化劑的酶活力最高達13 510 U/g，高于木聚糖酶在其他宿主中展示表達的酶活力［4，20］。錨定蛋白的選擇對展示表達的酶活力有一定的影響，后續(xù)研究可選用更多的錨定蛋白進一步提高DSB全細胞催化劑的酶活力［21］。

木聚糖酶在飼料、造紙、食品、紡織等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，然而在具體應(yīng)用過程中會有一些苛刻的環(huán)境條件，如高溫環(huán)境、強酸環(huán)境、高鹽環(huán)境、含有機溶劑的環(huán)境等，會對酶的活性造成很大的影響，從而降低了使用效率［22］。有研究表明在苛刻環(huán)境條件下全細胞催化劑較游離酶表現(xiàn)出更優(yōu)的穩(wěn)定性，Chen等［4］將來源于Cellulomonas fimi的木聚糖酶Cex展示表達在大腸桿菌細胞表面，Cex全細胞催化劑在40～65℃能維持70%以上的相對酶活力，而Cex游離酶在55℃時酶活力已降至43%，Cex全細胞催化劑在pH 6～8能維持約100%的相對酶活力，而Cex游離酶在pH 8時僅殘余29%相對酶活力；Yuzba?sheva等［10］在解脂耶氏酵母中構(gòu)建獲得脂肪酶Lip2p的全細胞催化劑，將全細胞催化劑和游離酶分別用EDTA、SDS、DMSO、Tween 80、Triton X-100試劑處理24 h，全細胞催化劑殘余的酶活力均高于游離酶。本研究將制備的DSB全細胞催化劑與DSB游離酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了比較，分析發(fā)現(xiàn)在70℃高溫條件和pH 3.0的酸性條件下，DSB全細胞催化劑的穩(wěn)定性均優(yōu)于DSB游離酶；此外在高濃度NaCl、高濃度甲醇、多種金屬離子（Na+、Ca2+、Ni2+）的環(huán)境條件下，DSB全細胞催化劑均能維持較高的酶活力且穩(wěn)定性優(yōu)于DSB游離酶，為DSB全細胞催化劑的工業(yè)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，也為獲得穩(wěn)定性更好的酶制劑提供一定的理論基礎(chǔ)。