復方補氣口服液的質量標準研究

王葉子，張 營，周 琪，干國平，談仲川，張雁淼

（湖北中醫藥大學藥學院/湖北省中藥炮制工程技術研究中心，武漢430065）

復方補氣口服液為炙黃芪、人參、菟絲子等10味中藥材組成的復方制劑，具有補氣固表、補益肝腎的功效。復方中炙黃芪為君藥，具有扶正固本的功效，主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類成分，其中黃芪甲苷具有增強機體免疫力、抗病毒等藥理作用，常作為黃芪的重要指標成分［1，2］。為提高復方補氣口服液質量的可控性和穩定性，保證臨床用藥安全，本研究參考有關文獻［3-9］，采用薄層色譜法（TLC）建立制劑中炙黃芪、人參、菟絲子的鑒別方法，同時采用高效液相-蒸發光散射檢測器（HPLCELSD）法建立制劑中黃芪甲苷的含量測定方法，并進行方法學驗證，為該制劑的質量控制提供定性定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜儀；Agilent Technologies 1260 Infinity ELSD檢測器；梅特勒-托利多AT十萬分之一天平；Sartorius BS210S電子分析天平（萬分之一）；AS系列超聲波清洗機，220 V/50 Hz，天津市特賽恩斯儀器有限公司；ZF-7三用紫外分析儀，254 nm/365 nm，上?？等A生化儀器制造廠；HH-2數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.2 藥品與試劑

復方補氣口服液（批號為180723、180724、190523，湖北華仁藥業提供）、黃芪甲苷對照品（批號110781-201717）、人參對照藥材（批號180303）、人參皂苷Rg1對照品（批號180610）、人參皂苷Rb1對照品（批號181021）、人參皂苷Re對照品（批號190105）、金絲桃苷對照品（批號111521-201708）均購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠G，薄層層析用，批號為0190423，青島海洋化工有限公司；層析用中性Al2O3，批號為F20040304，國藥集團化學試劑有限公司；高純度氮氣，由明輝氣體有限公司提供；水為純凈水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1）炙黃芪供試品溶液的制備。取本品30 mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇，用氨試液洗滌3次，每次20 mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加20 mL水溶解，通過D101型大孔樹脂柱（柱內徑為1.5 cm，柱高為12 cm），用40 mL水洗脫，棄去洗脫液，用70%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘渣加1 mL甲醇溶解，即得。

對照品溶液的制備：取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，即得。

陰性對照溶液的制備：按制劑處方和工藝制備缺炙黃芪的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2）人參供試品溶液的制備。取本品50 mL，加二氯甲烷提取3次，每次30 mL，棄去二氯甲烷液，水層加水飽和正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液。正丁醇液加氨試液提取2次，每次20 mL，棄去氨試液，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，注入中性氧化鋁柱（100～200目，12 g，內徑為10～15 mm），用100 mL 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，即得。

對照藥材溶液的制備：取人參對照藥材1 g，加50 mL水煎煮30 min，濾過，取濾液，按照供試品溶液制備方法制備，即得。

對照品溶液的制備：取人參皂苷Rb1、Re及Rg1對照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的混合對照品溶液，即得。

陰性對照溶液的制備：按制劑的處方和工藝制備缺人參的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

譯文：因為維諾娜的至尊十字架到哈德良長城與到懷特島距離相等，所以羅馬人把該處視為英國的中心。（先因后果）

3）菟絲子供試品溶液的制備。取本品20 mL，加石油醚（60～90℃）30 mL振搖提取，棄去石油醚液，水液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加5 mL水攪拌溶解，通過已處理好的聚酰胺柱（100～200目，0.6 g，內徑約1.2 cm，濕法裝柱），用30%乙醇30 mL沖洗，再用70%乙醇20 mL洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣用0.5 mL甲醇溶解，即得。

對照品溶液的制備：取金絲桃苷對照品，加甲醇制成0.25 mg/mL的溶液，即得。

陰性對照溶液的制備：按制劑的處方和工藝制備缺菟絲子的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

1.3.2 含量測定

1）對照品溶液的制備。精密稱取黃芪甲苷對照品5.08 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：精密量取樣品50 mL，置于分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次30 mL，棄去氨液，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

陰性對照溶液：除炙黃芪藥味外，按處方比例取其他藥材，按照制劑的制備工藝制得黃芪陰性樣品。精密量取陰性樣品50 mL，按照供試品溶液制備方法同法制備，即得。

2）色譜條件。色譜柱YMC-Triart C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈-水（32∶68），流速1 mL/min，漂移管溫度100℃，氣體流速1.6 mL/min，柱溫25℃。

2 結果與分析

2.1 薄層鑒別

2.1.1 炙黃芪按《中華人民共和國藥典》（通則0502法）進行試驗［10］。分別吸取上述炙黃芪供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液為展開劑展開，取出晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，分別在日光和紫外光（365 nm）下檢視。結果表明，日光下供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上顯相同的棕褐色斑點；紫外光燈（365 nm）下顯相同的橙黃色熒光斑點，陰性樣品無干擾（圖1）。

2.1.2 人參分別吸取上述人參供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各3μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，置于展開劑預飽和30 min的展開缸內展開，取出晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，揮干，在105℃烘至顯色斑點清晰，于日光和紫外光燈（365 nm）檢視。結果表明，供試品色譜在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點，陰性樣品無干擾（圖2）。

圖1 復方補氣口服液中炙黃芪的TLC

2.1.3 菟絲子分別吸取上述菟絲子供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各2μL，以條帶狀點樣于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶2）為展開劑展開，取出晾干，噴5%三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱5 min，立即于紫外燈（365 nm）下檢視。結果表明，供試品色譜在與金絲桃苷對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾（圖3）。

圖3 復方補氣口服液中菟絲子的TLC

2.2 方法學考察

2.2.1 系統適用性與專屬性試驗精密吸取供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，對照品溶液5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜。結果表明，供試品色譜在與黃芪甲苷對照品色譜主成分峰（20.803 min）相近保留時間處有一對應的成分峰；陰性樣品在此保留時間處無色譜峰，即陰性樣品無干擾，表明該方法專屬性好（圖4）。

供試品色譜中，黃芪甲苷峰與相鄰成分峰之間完全分離，分離度R=2.53，理論板數按黃芪甲苷峰計算為18 000。取對照品溶液連續進樣6次，測得黃芪甲苷峰面積的RSD為0.67%，黃芪甲苷峰保留時間的RSD為0.16%（n=6），表明儀器的精密度較好，系統適用性試驗符合要求。

2.2.2 溶液穩定性的考察分別取室溫條件下貯存的供試品溶液、對照品溶液于0、3、6、9、12 h進樣分析。測得黃芪甲苷峰面積對數值的RSD分別為1.17%、0.68%（n=5），表明供試品溶液和對照品溶液在室溫下放置12 h基本穩定。

圖4 復方補氣口服液專屬性試驗

2.2.3 精密度取同一批樣品，按照“1.3.2”項制備供試品溶液，平行制備6份。精密量取供試品溶液10 mL，對照品溶液5、20μL，進樣分析。采用外標兩點法對數方程計算6份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD值，即為重復性精密度。

取同一批樣品，由不同人員、在不同時間操作分析，按照“1.3.2”項制備供試品溶液，平行制備6份。精密量取供試品溶液10μL，對照品溶液5、20μL，進樣分析。計算6份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD值，即為中間精密度，再與重復性試驗的6份測定結果一并分析RSD值。結果表明，重復性試驗6份供試品溶液中黃芪甲苷平均含量為57.84μg/mL，RSD為4.27%；中間精密度試驗6份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD為4.12%。12份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD為4.01%，表明該方法精密度良好。

2.2.4 線性與范圍精密稱取黃芪甲苷35.06 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻即得對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分別置于5個10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，即得5個不同濃度的對照品溶液。精密量取各種濃度的對照品溶液20μL，進樣分析。以黃芪甲苷峰面積對數值（Y）為縱坐標，以黃芪甲苷進樣質量對數值（X）為橫坐標，計算回歸方程。所得回歸方程為Y=1.673 5X+1.926 3，R2=0.999 2（n=5），表明黃芪甲苷進樣質量在1.402～14.024μg進樣質量對數值與峰面積對數值具有良好的線性關系。

2.2.5 定量限取對照品溶液，逐漸稀釋至對照品溶液色譜中黃芪甲苷峰的信噪比約為10時，測得黃芪甲苷的定量限為0.86μg。

2.2.6 加樣回收試驗精密量取已知含量的樣品25 mL，共6份，置于分液漏斗中，分別精密加入對照品儲備液（0.055 92 mg/mL）25 mL，制備加標供試品溶液，測定并計算加樣回收率。結果表明，黃芪甲苷的平均回收率為99.40%，RSD為4.15%（n=6），說明該方法準確（表1）。

表1 黃芪甲苷加樣回收率試驗結果

2.3 樣品測定

取3批樣品，按“1.3.2”的方法制備供試品溶液，以外標兩點法計算黃芪甲苷的含量。結果表明，3批樣品的黃芪甲苷含量分別為57.84、55.18、58.76 μg/mL。

3 討論

試驗在方法學考察的同時對方法的耐用性進行研究，包括溶劑的提取次數、漂移管溫度、柱溫。結果表明，供試品溶液制備時，采用水飽和正丁醇提取3、4、5次，對黃芪甲苷含量測定結果無顯著性差異；漂移管溫度在75～100℃時，柱溫在25～35℃均對黃芪甲苷的含量測定結果無顯著影響，但柱溫為22℃時，供試品溶液色譜中黃芪甲苷峰分離度小于1.5，表明低柱溫不利于被測成分的分離。

本研究建立的TLC法和HPLC法受主客觀因素的干擾較小，準確、簡便，重復性好，可為該制劑的質量控制提供定性定量檢測方法。