不同培養基組分對牛支原體生長的影響

嚴明帥，徐業芬，張馮禧，索朗斯珠，牛家強

（1.西藏農牧學院動物科學學院，西藏 林芝860000；2.西藏農牧學院西藏高原動物疫病研究自治區高校重點實驗室，西藏 林芝860000）

牛支原體歸屬于支原體科支原體屬，是造成牛呼吸道疾病的重要病原之一［1］。除了可以導致犢牛肺炎、關節炎和奶牛乳腺炎外，還可以造成角膜結膜炎、中耳炎、生殖道炎癥、流產與不孕等疾病［2］。牛群感染以后很難徹底根除，帶菌狀態可達數月甚至數年，其主要傳播途徑通過飛沫經呼吸道傳播，還可以通過近距離接觸、生殖道接觸和吮吸乳汁等途徑傳播［3］。Hale等［4］在1961年首次從患乳腺炎的病牛中分離到牛支原體，此后在歐洲等地流行并對養牛業造成巨大的經濟損失。在中國，陳嘉棣等［5］在1983年首次從患有乳房炎的牛乳中分離到牛支原體，之后有零星報道牛支原體的感染。辛九慶等［6］在2008年從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體，此后牛支原體在中國部分地區普遍流行，并造成一定的經濟損失，石磊等［7］、冉智光等［8］、姚永進等［9］相繼報道于患病肉牛及奶牛體內分離并鑒定得到牛支原體，除原發性感染發病外，牛支原體還可以與其他病原造成混合感染，對中國養牛業危害極大。

牛支原體胞質內含有雙股DNA和核糖體，基因組很小，大約為1 080 kb［10］，其基因組攜帶的信息量和生物的合成以及代謝能力十分有限，因此培養牛支原體的人工培養基中需要添加其生存所必需的營養物質［11］，除了在培養基中添加脂肪酸和核酸前體外，還需要加入一定量的血清，為其生長提供所需的膽固醇和脂肪酸，還要添加葡萄糖和丙酮酸作為其能量來源［12］。目前實驗室用于培養牛支原體經常使用的培養基存在培養時間長、成本較高等問題，不利于牛支原體的大量培養［13］。本試驗選用3種類型的血清和4個廠家生產的瓊脂，按照含量為5%～15%的血清添加量制備9種液體培養基；在添加血清類型和含量的基礎上制備4種固體培養基，來驗證其對牛支原體的生長影響，為今后牛支原體培養基的篩選和疫苗的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

牛支原體分離株由西藏高原動物疫病研究自治區高校重點實驗室分離、鑒定與保存［14］。

1.2 主要試劑

PPLO Broth、Yeast Extract、Agar均 購 自BD公司；丙酮酸鈉購自青島海博生物技術有限公司；馬血清購自Hyclone公司、豬血清購自上海恒遠生物科技有限公司、胎牛血清購自廣州蕊特生物科技有限公司；氫氧化鈉購自天津市致遠化學試劑有限公司；青霉素鈉購自山東聖旺藥業股份有限公司；瓊脂購自上海某公司、成都某公司、香港某公司。

1.3 試驗用溶液的制備

0.1 moL/L NaOH溶液：用天平稱取4 g NaOH，之后轉移到燒杯內，加入少量去離子水使其溶解，完全溶解后轉移到容量瓶中定容至1 000 mL，搖勻后4℃保存，備用。

0.4%酚紅溶液：用天平稱取酚紅0.4 g放入研缽內、逐滴加入0.1 moL/L的NaOH溶液10 mL，研磨使其完全溶解，然后加入到容量瓶中用去離子水定容至100 mL，經濾紙過濾后4℃保存，備用。

40萬U/mL青霉素溶液：向400萬U的青霉素粉末中加10 mL去離子水，混勻后4℃保存，備用。

1.4 培養基的制備

牛支原體培養基的配制：PPLO Broth 21 g/L，Yeast Extract 5 g/L，丙酮酸鈉1 g/L，dd H2O 880 mL，116℃高壓滅菌18 min，冷卻至50～60℃，加入10X MEM 10 mL，40萬U/mL青霉素2 mL/L，0.4%酚紅溶液4.5 mL/L，4℃保存，備用。血清量的添加參照郭澍強［15］的研究結果，按照5%、10%、15%的血清濃度依次制備了9種液體培養基，具體見表1。在此基礎上，用4個廠家生產的瓊脂依次制備了4種固體培養基，分別編號為10（BD公司）、11（香港某公司）、12（上海某公司）和13（成都某公司）。

1.5 OD值測定法

將復蘇的牛支原體菌液按1∶10比例分別接種于液體培養基1～9，每種培養基設3個重復，置37℃5% CO2恒溫箱中培養，每隔12 h分別從各培養基中取樣，在630 nm波長下測定其OD值，最后分別各取平均值作為培養基OD值［13］。

1.6 固體培養基評價指標

取復蘇后牛支原體菌液50μL，分別接種于4種固體培養基（10、11、12、13），每種培養基設3個重復，置37℃5% CO2恒溫培養箱中培養3～5 d，以其固體培養基的外觀、菌落生長情況、菌落形態特征作為培養基的性能評價指標［16］，具體情況見表2。

1.7 數據統計分析

應用SPSS 21.0軟件對OD值檢測數據進行顯著性分析，若P＞0.05，則差異不顯著；若P＜0.05，則差異顯著；若P＜0.01，則差異極顯著。

表2 固體培養基性能指標評價數值

2 結果與分析

2.1 血清類型和濃度對牛支原體生長的影響

接種了牛支原體的9種液體培養基，置37℃5% CO2恒溫箱中培養，每隔12 h取菌液，進行OD值測定，測定結果見表3、表4、表5、表6、表7、表8。結果表明：牛支原體在9種液體培養基中均在培養至60 h時其OD值達到最大；在添加相同血清濃度的情況下，經顯著性分析顯示，培養基1與4、7相比差異顯著（P＜0.05），培養基4與7相比差異不顯著（P＞0.05）；培養基2與5、8相比差異顯著（P＜0.05），培養基5與8相比差異不顯著（P＞0.05）；培養基3與6、9相比差異顯著（P＜0.05），培養基6與9相比差異不顯著（P＞0.05）。該檢測結果說明牛支原體在添加了馬血清的培養基中生長狀態優于添加了豬血清和胎牛血清的培養基。

在添加相同類型血清的情況下，培養基2、3與1相比差異顯著（P＜0.05），而培養基2與3相比差異不顯著（P＞0.05）；培養基4、5、6之間相比差異不顯著（P＞0.05）；培養基7、8、9之間相比差異不顯著（P＞0.05）。該檢測結果說明血清濃度對牛支原體生長造成的影響不大，基于培養基成本考慮選擇添加10%血清的培養基作為今后培養牛支原體的使用量。

表3 添加5%血清的培養基在不同時間點的OD值檢測結果

表4 添加10%血清的的培養基在不同時間點的OD值檢測結果

表5 添加15%血清的的培養基在不同時間點的OD值檢測結果

表6 添加了馬血清的培養基在不同時間點的OD值檢測結果

表7 添加了豬血清的培養基在不同時間點的OD值檢測結果

表8 添加了胎牛血清的培養基在不同時間點的OD值檢測結果

2.2 不同廠商瓊脂對牛支原體生長影響

接種了牛支原體菌液的4種固體培養基培養3～5 d，肉眼觀測培養基外觀及菌落生長狀況，并在低倍鏡下觀察菌落形態，性能指標評價結果見表9。結果表明，培養基10外觀良好，表面平整，無裂縫；牛支原體生長良好、菌落數目多，呈均勻一致；低倍鏡觀察菌落形態呈典型的“油煎蛋樣”；培養基性能指標得分為9分。培養基11外觀正常，表面凹凸不平；培養基上有牛支原體生長，但菌落數目較少，分布不均勻；低倍鏡下菌落形態不典型；培養基性能指標得分為7分。培養基12外觀較差，表面凹凸不平；培養基上有牛支原體生長，但菌落數目少，分布不均勻；低倍鏡下菌落形態不典型；培養基性能指標得分為5分；培養基13外觀正常，但表面有裂縫；培養基上有牛支原體生長、但菌落數目稀少，分布一般；低倍鏡下菌落形態不典型；培養基性能指標得分為6分。以上結果說明，由BD公司生產的瓊脂所制備的培養基性能指標最優。

表9 4種固體培養基性能指標評分結果

3 小結與討論

本試驗選用3種類型的血清，按照5%、10%、15%的血清濃度依次制備了9種液體培養基，采用OD值檢測法對牛支原體生長情況進行研究，結果表明，牛支原體在添加了馬血清的培養基中生長狀態優于添加了豬血清和胎牛血清的培養基。且10%與15%血清濃度對牛支原體生長造成的影響不大，基于培養基成本考慮選擇添加10%血清的培養基作為今后牛培養支原體的使用量。在此基礎上，用4個廠商瓊脂依次制備了4種固體培養基，分別進行了牛支原體生長試驗。結果表明，添加BD公司的瓊脂所制備的固體培養基最適宜牛支原體的生長。

牛支原體病在全世界范圍內流行，患病牛和帶菌牛是該病的主要傳染源，牛群一旦感染很難徹底清除，牛的發病率為50%～100%，病死率可達10%～50%，給養牛業帶來巨大的經濟損失［17］。在臨床治療過程中，藥物的治療效果不佳，因此，疫苗對該病的防控起到關鍵的作用，而選出生長快、滴度高的培養基是疫苗生產過程中的關鍵環節，目前所使用的培養基存在培養時間長、成本高和效率低，不適用于牛支原體的大量培養［18］。為此探索高效率的培養基為牛支原體的大量培養提供參考，并開發有效疫苗防控牛支原體病，保障養牛業的健康、快速發展。

對牛支原體分離培養時要求較高，不僅要無菌采集病變的組織樣本，且在對樣本的處理及培養全過程都要求嚴格無菌操作，增加了分離難度。牛支原體的基因組很小，只有典型細菌基因組的20%～40%，合成物質的能力和攜帶的信息量有限，因此，需要通過宿主細胞獲取生長所需的營養物質，且體外培養時對培養基的營養物質成分要求很高，培養條件也很苛刻［19］。培養基中需加入血清、酵母粉、MEM等營養物質，并在37℃5% CO2環境中恒溫培養3～5 d［20］，在液體培養基中呈現澄清透明無沉淀或少許沉淀的黃色，固體培養基中的菌落在低倍鏡下可觀察到典型的“煎蛋狀”或“臍狀”的菌落形態［21］。培養基中還需加入抗生素，以達到抑菌作用［22］。目前所用的培養基雖然能夠提供膽固醇、氨基酸和維生素等營養物質，但存在培養時間長、效率低等弊端，因此需要改良出培養成本低、效率高的培養基，不僅用于牛支原體的大量培養，且對今后疫苗的研發有著重要的意義。本次試驗選用3種動物的血清，按照5%、10%、15%的血清濃度依次制備了9種液體培養基，采用OD值檢測法比較牛支原體在9種液體培養基中的生長情況，結果表明，牛支原體在9種液體培養基中均可生長，在培養至60 h時其OD值達到最大。在添加血清濃度相同的情況下，添加馬血清培養基的OD值與添加豬血清或胎牛血清培養基的OD值相比差異顯著，說明牛支原體在添加了馬血清的培養基中生長狀態優于添加了豬血清和胎牛血清的培養基。在添加相同類型血清的情況下，添加豬血清或胎牛血清的各培養基之間的OD值相比差異不顯著，而添加馬血清的各培養基之間的OD值相比，添加量10%和15%與5%相比差異顯著，而10%與15%相比差異不顯著，說明血清濃度對牛支原體生長造成的影響不大，基于培養基成本考慮選擇添加10%血清的培養基作為今后培養牛支原體的使用量。

瓊脂雖然無營養成分只是作為培養基的凝固劑和載體，但是培養基的凝膠強度過高，會造成菌落生長偏小，而培養基凝膠強度過低時，會影響培養基的外觀，造成培養基表面不平整、不均勻有裂縫［23］。另一方面，不同廠商生產瓊脂采用的原料也不相同，目前市場上主要使用的是石花菜和江蘺，由2種原料生產出的瓊脂粉凝固點有很大的差異，并且不同廠商或同一廠商不同批號生產的瓊脂其凝固強度也存在很大差異，將會對培養基的性能影響很大，從而影響微生物的生長和形態特征［24］。本次試驗在血清添加種類和濃度的基礎之上，選用4種廠商生產的瓊脂制備固體培養基，接種一定濃度的牛支原體放入37℃、5% CO2恒溫培養箱培養，通過比較4種固體培養基的外觀、牛支原體生長情況和菌落形態，結果表明，由BD公司生產的瓊脂制備的固體培養基的性能指標最好，不僅固體培養基外觀良好，而且牛支原體生長良好、菌落形態典型，適宜牛支原體固體培養基的制備。