ANRIL表達水平與妊娠期糖尿病的相關性分析

洪琳鳳 李樺 郭晴虹 肖鴿飛 金豐梅 尹保民 張超敏 嚴津晶 蔡鵬飛 李兆生

【摘要】 目的：分析細胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA（ANRIL）表達水平與妊娠期糖尿病（GDM）的相關性。方法：選擇2019年7月-2020年6月于本院產科進行產檢并分娩的妊娠期婦女122例，根據孕24～28周口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）結果是否異常將其分為OGTT異常組（n=61）和OGTT正常組（n=61）。比較兩組血清激素[雌二醇（E2）、孕酮（P）]水平以及l(fā)ncRNA ANRIL表達水平，分析lncRNA ANRIL表達水平與GDM患者激素水平的相關性。結果：兩組孕期體重增加、FPG、餐后1 h血糖、餐后2 h血糖比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。OGTT異常組血清E2、P水平均顯著高于OGTT正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。OGTT異常組血清lncRNA ANRIL mRNA表達水平顯著高于OGTT正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Pearson相關分析顯示，血清lncRNA ANRIL mRNA表達與GDM患者E2、P水平均呈明顯正相關（P<0.05）。logistic回歸模型分析結果顯示，lncRNA ANRIL是影響GDM發(fā)生的危險因素（P<0.001）。結論：GDM患者lncRNA ANRIL表達水平顯著升高，并與激素水平呈顯著正相關，lncRNA ANRIL表達升高可能是機體抵抗胰島功能的影響因素。

【關鍵詞】 妊娠期糖尿病 細胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA 雌二醇 孕酮 相關性

Correlation between ANRIL expression level and gestational diabetes mellitus/HONG Linfeng， LI Hua， GUO Qinghong， XIAO Gefei， JIN Fengmei， YIN Baomin， ZHANG Chaomin， YAN Jinjing， CAI Pengfei， LI Zhaosheng. //Medical Innovation of China， 2021， 18（05）： -146

[Abstract] Objective： To analyze the correlation between expression level of antisense non-coding RNA in the INK4 locus （ANRIL） and gestational diabetes mellitus （GDM）. Method： A total of 122 pregnant women who underwent obstetric examination and delivery in our hospital from July 2019 to June 2020 were selected. According to the abnormal results of oral glucose tolerance test （OGTT） at 24 to 28 weeks of pregnancy， they were divided into abnormal OGTT group （n=61） and normal OGTT group （n=61）. The levels of serum hormones [estradiol （E2）， progesterone （P）]and expression level of lncRNA ANRIL were compared between the two groups. The correlation between expression level of lncRNA-ANRIL and hormones levels were analyzed among GDM patients. Result： There were statistically significant differences in weight gain， FPG， 1 h postprandial blood glucose and 2 h postprandial blood glucose during pregnancy （P<0.05）. Serum E2 and P levels in the abnormal OGTT group were significantly higher than those in the normal OGTT group， with statistical significance （P<0.05）. The expression level of lncRNA ANRIL mRNA in serum of OGTT abnormal group was significantly higher than that of OGTT normal group， with statistical significance （P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that serum lncRNA ANRIL mRNA expression was significantly positively correlated with E2 and P levels in GDM patients （P<0.05）. Logistic regression model showed that lncRNA ANRIL was a risk factor for the occurrence of GDM （P<0.001）. Conclusion： The expression level of lncRNA ANRIL in patients with GDM is significantly increased， and is significantly positively correlated with the levels of hormones. The increase of lncRNA ANRIL expression may be an influencing factor for the bodys islet resistance function.

[Key words] Gestational diabetes mellitus Antisense non-coding RNA in the INK4 locus Estradiol Progesterone Correlation

First-authors address： Zhuhai Maternal and Child Health Care Hospital， Zhuhai 519000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.05.036

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus， GDM）是高危妊娠的重要原因之一[1]。早診斷、早治療對改善妊娠期糖尿病患者臨床結局有著極其重要的意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， lncRNA）是指一類無開放閱讀框的含有200個核苷酸的RNA，lncRNA參與了包括糖尿病在內的各種疾病的病理過程[2]。細胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA（antisense non-coding RNA in the INK4 locus， ANRIL）又被稱為lncRNA ANRIL，是最早發(fā)現的lncRNA之一[3]。全基因組關聯研究表明，lncRNA ANRIL是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）的遺傳易感位點[4]，染色體9p21區(qū)域糖尿病相關危險變異子與ANRIL表達的下調相關。目前研究認為，lncRNA ANRIL可能是通過調節(jié)INK4b-ARF-INK4a基因[5-6]，并通過多種機制參與2型糖尿病的發(fā)病過程。但其是否與GDM發(fā)病有關，目前未見相關報道。據此，本文通過研究ANRIL表達水平與妊娠期糖尿病的相關性，旨在為妊娠期糖尿病的早診斷、早治療提供新的參考根據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年7月-2020年6月于本院產科進行產檢并分娩的妊娠期婦女122例，年齡22～42歲，年齡（31.35±4.32）歲。根據孕24～28周口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）結果是否異常將其分為OGTT異常組（n=61）和OGTT正常組（n=61）。（1）納入標準：①OGTT異常組符合妊娠期糖尿病診斷標準[7];②均為單胎妊娠;③孕前均無糖尿病史。（2）排除標準：①合并妊娠期高血壓;②其他內分泌疾病或激素相關疾病;③存在其他可能影響血糖水平的基礎疾病;④唐氏篩查及三維超聲提示胎兒異常;⑤近期服用對血糖水平造成影響的藥物。患者及其家屬知情同意，并簽署知情同意書。本次研究得到珠海市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 入選對象在第1次產前檢查時（孕11～13+6周），于空腹狀態(tài)下測量血壓、身高、體重、孕次、產次，同時檢測其糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c， HbA1c）、空腹血糖（fasting plasma glucose， FPG），結果均正常，排除糖尿病合并妊娠。至孕24～28周進行OGTT及血清激素[雌二醇（estradiol， E2）、孕酮（progesterone， P）]檢測，并檢測外周血lncRNA ANRIL基因表達。

1.2.2 血清生化指標檢測 孕24～28周，入選對象均于禁食12 h后，募集晨起空腹靜脈血4 mL，4 ℃靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，留上清，采用化學發(fā)光法檢測兩組E2、P水平。

1.2.3 血清lncRNA ANRIL表達檢測 采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction， qRT-PCR）檢測孕婦血清lncRNA ANRIL相對表達量，具體步驟如下，（1）血清樣本收集：收集兩組孕婦空腹靜脈血4 mL，方法同上，-80 ℃超低溫凍存;（2）血清總RNA提取：采用過濾柱層析法RNA提取試劑（聚合美，北京）抽提淋巴細胞的總RNA，用First strand cDNA synthesis試劑盒（艾基生物，廣州）將總RNA反轉錄生成互補脫氧核糖核酸（cDNA），使用Ipure SYBR Green qPCR Master Mix universal試劑盒（艾基生物，廣州）對cDNA進行相對定量檢測;（3）qRT-PCR分析：實時熒光定量PCR擴增儀為ABI-7500 RT-PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國），選擇的程序為“Relative Quantification （ddCt） Plate”[相對定量（ddCt）反應板]，上機前的實驗操作均在冰板上進行，所有實驗耗材均已去RNA酶處理，PCR參數為：95 ℃15 min→95 ℃15 s、56 ℃30 s、72 ℃40 s，45個循環(huán)→95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s，60 ℃15 s，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）作為內參，所有qRT-PCR均做3復孔檢測，采用2-△△Ct進行基因相對定量水平的計算。見表1。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。血清lncRNA ANRIL表達與GDM患者激素水平的相關性用Pearson相關檢驗分析，GDM發(fā)生的影響因素采用二元logistic回歸模型分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較 兩組孕婦年齡、體質指數、身高、孕前體重、分娩時體重、孕次、產次、HbA1c比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。兩組孕期體重增加、FPG、餐后1 h血糖、餐后2 h血糖比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2 兩組血清激素水平比較 OGTT異常組血清E2、P水平均顯著高于OGTT正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

2.3 兩組血清lncRNA ANRIL表達水平比較 OGTT異常組血清lncRNA ANRIL mRNA表達水平為（1.21±0.31），顯著高于OGTT正常組的（0.73±0.19），差異有統(tǒng)計學意義（t=9.845，P<0.05）。

2.4 血清lncRNA ANRIL表達與GDM患者激素水平的相關性分析 Pearson相關分析顯示，血清lncRNA ANRIL mRNA表達與GDM患者E2、P水平均呈明顯正相關（r=0.379，P=0.003;r=0.507，P<0.001），見圖1。logistic回歸模型分析結果顯示，剔除血糖、激素水平等因素影響，lncRNA ANRIL是影響GDM發(fā)生的危險因素[OR=5 055.075，95%CI（268.506，95 170.299），P<0.001]。

3 討論

GDM是指妊娠期出現或首次發(fā)現的葡萄糖不耐受，是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一[8]。GDM患者可發(fā)生代謝和免疫變化，臨床上表現為胰島素抵抗和對胎兒及胎盤免疫耐受增加[9]。此外，GDM患者不良妊娠結局風險明顯增加，進而對母體和胎兒造成威脅[10]。GDM危險因素包括孕前體重增加、肥胖、糖尿病家族史、高齡及飲食不良等，亦有研究指出，孕早期低甲狀腺激素水平與GDM風險增加有關，并可能影響妊娠結局和嬰兒智力水平[11]。然而GDM病因和發(fā)病機制并不完全明確。目前臨床診斷GDM的方法仍依賴于OGTT，血糖一項及以上達到或超過異常標準可診斷。但隨著孕周增加，孕婦體內拮抗胰島素樣物質增加，如雌激素、孕激素、HPL等使孕婦對胰島素的敏感性隨孕周增加而下降，故部分孕婦孕中期OGTT正常，但隨著孕周的增加，孕晚期可能出現OGTT，而該部分患者容易漏診或確診延遲，進而引起嚴重后果。因此尋找新的生物標志物，對于GDM的發(fā)現和治療具有重要意義。

lncRNA不編碼蛋白質，廣泛存在于基因組中，lncRNA表達異常與多種疾病有關。lncRNA ANRIL主要定位于細胞核，又被稱為CDKN2B-AS，是人Chr9p21.3上INK4b（CDKN2B）-ARF-INK4a（CDKN2A）基因簇轉錄的長鏈非編碼RNA[12]。證據表明，lncRNA ANRIL異常表達以及單核苷酸多態(tài)性與包括糖尿病在內的疾病有關[13]。Guo等[14]報道指出，lncRNA ANRIL通過介導NF-κB信號通路促進人冠狀動脈內皮細胞炎性細胞因子釋放，其表達與冠心病患者累積存活時間呈顯著負相關。亦有研究指出，CDKN2A/B基因異常甲基化可能與胰島β細胞功能障礙和糖尿病有關[15]。進一步研究發(fā)現，CDKN2A/B位點單核苷酸多態(tài)性rs564398等位基因攜帶者降低了T2DM患者胰島β細胞增殖指數，其可能通過調節(jié)胰島基因表達和胰島β細胞增殖而影響T2DM發(fā)病[16]。故認為lncRNA ANRIL可能是預測GDM的新型生物標志物。本文研究結果顯示，OGTT異常組血清E2、P水平均顯著高于OGTT正常組（P<0.05），表明GDM患者激素水平顯著升高。具體而言，胰島素抵抗是糖尿病的主要生理特征，妊娠期間由于雌激素、P的合成以及胎盤的生成，E2、P水平逐漸升高，進而影響胰島素功能，導致胰島功能降低，故激素水平可在一定程度上指示GDM患者病情嚴重程度。本文研究結果還顯示，OGTT異常組血清lncRNA ANRIL mRNA表達水平顯著高于OGTT正常組（P<0.05），表明GDM患者lncRNA ANRIL mRNA表達明顯上調，并可能參與了GDM發(fā)病過程。分析原因，CDKN2A/B能夠調節(jié)胰島β細胞分泌胰島素，其單核苷酸多態(tài)性可能影響胰島β細胞增殖能力以及限制胰島β細胞數量代償性增加，來增加胰島β細胞敏感性，進而參與GDM發(fā)病過程，此外，CDKN2A/B還具有調節(jié)淋巴細胞增殖以及分化的效應，而lncRNA ANRIL又具有調節(jié)CDKN2A/B基因座表達的作用，因此lncRNA ANRIL可能在GDM發(fā)病過程中發(fā)揮作用。進一步相關檢驗分析結果顯示，GDM患者E2、P水平升高時其血清lncRNA ANRIL表達也升高，血清lncRNA ANRIL表達與E2、P水平均呈明顯正相關，且lncRNA ANRIL是影響GDM發(fā)生的危險因素，表明lncRNA ANRIL對GDM發(fā)生可能起促進作用，其高表達可能促進GDM發(fā)生。

綜上所述，GDM患者lncRNA ANRIL表達水平顯著升高，并與激素水平呈顯著正相關，lncRNA ANRIL表達升高可能是機體抵抗胰島功能的影響因素，從分子水平研究與GDM發(fā)病相關基因，為GDM早期診斷及未來基因治療預防有著重要的臨床意義。然而GDM發(fā)病機制相當復雜，lncRNA ANRIL在GDM中發(fā)揮的具體作用機制仍然有待進行更多體內外研究。

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（收稿日期：2020-11-18） （本文編輯：姬思雨）