UPLC-MS/MS法測野拔子蜂蜜中11種喹諾酮類藥物殘留

攀枝花學院（攀枝花 617000）

野拔子（Elsholtzia rugulosaHemsl.），別名野壩子[1]，為中國西南地區主要的秋、冬蜜源植物，花期在10月下旬至12月上旬，主要開花流蜜期在30～40 d[2]。野拔子蜂蜜被稱為“金牌蜜”，屬于天然營養佳品，為蜜中上品[3]，具有較好的食用價值和藥用價值。但蜜蜂在日常生產中容易受到細菌、真菌、病毒和外來寄生螨類的侵染而引起病害[4]。喹諾酮類藥物在蜂業生產中通常用來防治和治療各類細菌疾病，尤其是可以有效地防治美洲幼蟲腐臭病引起的蜜蜂數量減少和蜂蜜產量降低[5]。目前，GB 31650—2019關于蜂蜜中除“雙甲脒”和“氟胺氰菊酯”外，無其他獸藥最大殘留限量值規定[6]，國家的養蜂業對喹諾酮類藥物禁止使用，因而要嚴格控制喹諾酮類藥物在養蜂生產中的用量，有必要建立野拔子蜂蜜的喹諾酮類藥物的痕量檢測方法。

目前，國家標準[7-8]和部分文獻[9-11]關于蜂蜜產品測定喹諾酮類藥物殘留量的方法較多，且液相色譜-串聯質譜法是測定喹諾酮類殘留方法中最為通用的檢測手段，但樣品前處理對雜質干擾處理效果不佳（基質成分復雜）或多種喹諾酮類藥物在色譜分析中分離效果和靈敏度有待進一步提高。此次試驗在前人研究工作的基礎上，細化了檢測對象，適當改進了樣品前處理方法，采用超高效液相色譜-串聯質譜法對野拔子蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留量進行了測定，該方法具有此色譜分析高效、高靈敏度等優點，其方法的回收率和重現性好，可滿足野拔子蜂蜜的喹諾酮類藥物殘留的評估檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯四極桿質譜儀，美國Agilent 公司；FA2014B電子天平，上海越平公司；Milli-Q IQ7000超純水器，美國Millipore公司；1-14k離心機，Sigma公司；VORTEX 4渦旋混合器，LMS公司；NEVAP-45氮吹儀，美國Organomation公司；Oasis HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL）。

色譜級甲酸、乙腈、甲醇，Fisher公司；氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、環丙沙星、達氟沙星（單諾沙星）、雙氟沙星、恩諾沙星、噁喹酸（奧索利酸）、氟甲喹、沙拉沙星等11種標準品（純度均大于98%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；其它試劑為國產分析純。樣品為云南和四川市售不同廠家的野拔子蜂蜜商品。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別稱取0.010 0 g 11種喹諾酮類標準品，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，質量濃度均為1.0 mg/mL，于-20 ℃避光保存。其他濃度標準溶液用甲醇定量稀釋即得。

1.2.2 樣品前處理

提取：稱取5.0 g（精確到0.01 g）野拔子蜂蜜，置于50 mL離心管中，加入20 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 3.0），以1 000 r/min 旋渦混合1 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min 離心5 min（溫度低于5 ℃），提取2次，合并上清液，過濾，待凈化。

凈化：依次用6 mL甲醇活化和6 mL水平衡Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL），上樣，調節流速以2～3 mL/min 的速度將樣品提取溶液過柱，棄去濾液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱抽干，加入6 mL甲醇洗脫并收集洗脫液。洗脫液用氮氣吹干，用1 mL 0.2%甲酸水溶解殘渣，以1 000 r/min 漩渦混合1 min，過0.22 μm濾膜，即得。

1.2.3 儀器條件

色譜條件，色譜柱ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相，（A）體積分數40%甲醇-乙腈溶液∶（B）體積分數0.2%甲酸-水溶液，梯度洗脫；流速，0.3 mL/min；進樣體積，10 μL；洗脫程序，0～6 min，流動相A 70%；6～9 min，A由70%降至50%；9～9.5 min，A由50%降至0%；9.5～10.5 min，A為0%；10.5～11 min，A由0%升至90%；11～15 min，A為90%。

質譜條件：離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應監測（MRM）；輔助氣（AUX）流速11 L/min；輔助氣溫度（TEM）350 ℃；電噴霧電壓（IS）4 000 V。11種喹諾酮類藥物的多反應監測質譜參數見表1。

表1 多反應監測模式下11種藥物的質譜參數

1.2.4 方法的標準曲線、線性范圍及檢出限[12-13]

將配制好的11種喹諾酮類藥物標準儲備液用甲醇稀釋成200 μg/L混合標準溶液，用空白野拔子蜂蜜基質提取液將混合標準溶液稀釋成1.0，2.0，5.0，10，20，50，80和100 μg/L系列質量濃度的混合標準溶液分別進行測定。以質量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，采用外標法建立標準曲線。以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）分別確定檢出限（LOD）與定量限（LOQ）。

2 結果與分析

2.1 樣品提取與凈化

樣品處理是殘留分析的關鍵，野拔子蜂蜜中含有大量的葡萄糖、果糖、有機酸等，這些組分的存在對藥物的干擾很大，因而必須進行樣品前處理。以0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 3.0）作為提取劑時，11種喹諾酮類藥物的回收率較好，在80%～110%之間，且pH變化對其穩定性有一定影響，樣品中的11種喹諾酮類藥物用磷酸鹽緩沖溶液在pH 3.0時可以提高提取效率，且選擇Oasis HLB固相萃取柱，填料為聚合物，回收率均在85%以上，可有效除去干擾物質，滿足試驗要求。

2.2 色譜條件和質譜條件的優化

儀器條件中，流動相中加入少量甲酸（0.2%甲酸-水體系）能夠達到改善色譜峰的峰形、提高分離效率的作用，同時也為目標化合物提供必需的質子來源，提高其離子化效率。在ESI+模式下，優化碰撞能量，11種喹諾酮類藥物經過兩級碰撞掃描，產生不同強度的離子碎片，分別以豐度最大的荷質比（m/z）作為各目標化合物的定量離子，11種喹諾酮類藥物在50.0 μg/L時的定量離子色譜圖見圖1。

2.3 方法的線性關系及檢出限

向空白野拔子蜂蜜基質溶液中加入系列混合標準溶液，以峰面積對應的濃度進行線性回歸，11種喹諾酮類藥物在1.0～100.0 μg/L線性范圍內的相關系數均大于0.999，定量限為0.15～0.5 μg/kg，檢出限為0.05～0.15 μg/kg，均低于GB/T 23412—2009中的標準，其線性關系良好，結果見表2。

圖1 11種化合物的定量離子色譜圖

表2 11種藥物的線性范圍、回歸方程和相關系數

2.4 方法的回收率與精密度

以1，5和20 μg/kg的水平將11種藥物添加到空白野拔子蜂蜜基質中（空白樣品分別添加不同濃度的標準液，各6份），測定回收率，結果見表3。14種藥物在野拔子蜂蜜中的回收率為85.9%～104.9%，δRSD為4.3%～10.5%，回收率與精密度滿足農藥定量分析要求[14]。

表3 11種藥物的添加回收率和相對標準偏差（n=6）

2.5 實際樣品分析

按試驗方法對30份野拔子蜂蜜進行分析，11種喹諾酮類藥物的殘留量均低于檢測限和限量規定，未檢出。

3 結論

野拔子蜂蜜作為市場流通的蜂蜜產品，其藥物殘留引起越來越多的關注，同時國家的養蜂業對喹諾酮類藥物禁止使用，有必要對野拔子蜂蜜的喹諾酮類藥物殘留進行檢測。此次試驗結合固相萃取技術，以高效液相色譜-串聯質譜建立了野拔子蜂蜜中11種喹諾酮類藥物殘留的分析測定方法。該方法前處理操作簡單，凈化效果好，靈敏度高，干擾少，其11種喹諾酮類檢測低限（LOD值）為0.05～0.15 μg/kg，均小于GB/T 23412—2009標準檢測低限（1.0 μg/kg），樣品中11種喹諾酮類藥物均未檢出，在實際檢測中具有較強的可行性和實用性，可用于食品安全風險監測野拔子蜂蜜樣品的測定。