酶解法提取核桃粕中蛋白質(zhì)的工藝優(yōu)化

劉猛 ，樊鳳嬌，曲譜，楊守剛

1.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系（呂梁 033000）；2.山西省特色植物功能成分工程研究中心（呂梁 033000）；3.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（南京 210023）

核桃是深受群眾喜愛(ài)的一種的樹生堅(jiān)果，在世界上有著廣泛分布，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的珍貴果實(shí)。核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，有“萬(wàn)歲子”“長(zhǎng)壽果”“養(yǎng)生之寶”的美譽(yù)[1-2]。中國(guó)是世界上核桃起源地之一，現(xiàn)為世界第一大核桃生產(chǎn)國(guó)，擁有較大的種植面積和產(chǎn)量[3-4]。2014年中國(guó)核桃總產(chǎn)量271.37萬(wàn) t，占到全球年總產(chǎn)量1/2以上，居世界首位，并正以每年10%的速度增長(zhǎng)。核桃營(yíng)養(yǎng)豐富而味美，是優(yōu)良滋補(bǔ)高能食品，許多國(guó)家都有消費(fèi)核桃的習(xí)慣[5-7]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)于核桃油的保健價(jià)值較為重視并開展研究，卻忽視了生產(chǎn)核桃油剩余的副產(chǎn)物核桃粕的利用和研究。在去除大部分油脂的核桃粕中，其蛋白質(zhì)含量仍然很高，氨基酸組成豐富且合理，可作為一種物美價(jià)廉的純天然植物性蛋白源[8-10]。但在實(shí)際的生產(chǎn)加工中，富含蛋白質(zhì)的核桃粕一般被做成飼料使用或者直接被遺棄，使得核桃原料未能得到充分地利用，富含的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也因此流失而造成浪費(fèi)。同時(shí)，由于其高蛋白含量，將之直接丟棄，對(duì)環(huán)境帶來(lái)負(fù)面影響也較大，易造成土壤和水資源的富營(yíng)養(yǎng)化污染。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

核桃粕（河南圣府第油脂有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲基紅（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；亞甲基藍(lán)（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；堿性蛋白酶（食品級(jí)，河南安銳生物科技有限公司）；BCA試劑盒（生化試劑，上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

PHBJ-260便攜式pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器有限公司）；HH-6恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；JD200-3電子天平（賽多利科學(xué)儀器有限公司）；85-1恒溫磁力攪拌器（金壇市普瑞斯機(jī)械有限公司）；TDL-40B高速離心機(jī)（湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司）；EPOCH2型酶標(biāo)儀（北京瑞利分析儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃粕中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

測(cè)定核桃粕中蛋白質(zhì)含量，采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定[4-6]。

1.3.2 酶解蛋白的制備

稱取10 g被粉碎機(jī)粉碎的核桃粕粉，放入燒杯中，并倒入蒸餾水配制成核桃溶液。將樣液放置于磁力加熱攪拌器上加熱，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)控pH，加入堿性蛋白酶，酶添加量5 000 U/g，進(jìn)行酶解，酶解完成后，沸水浴高溫滅酶5 min后，冷卻至室溫，并用離心機(jī)以4 000 r/min離心15 min，上清液即是核桃蛋白，取上清液備用。在反應(yīng)過(guò)程中，用0.1 mol/L的NaOH溶液維持體系的pH[11-13]。

1.3.3 酶解液蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用BCA試劑盒測(cè)定酶解液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.4 單因素試驗(yàn)篩選酶解條件

選用堿性蛋白酶，通過(guò)pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比4個(gè)因素變化時(shí)，蛋白質(zhì)提取率的變化，研究對(duì)影響蛋白質(zhì)提取率的各個(gè)因素[14-16]。

1.3.4.1 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

稱取10 g核桃粕粉，放入燒杯中，并倒入蒸餾水配制成核桃液。磁力加熱攪拌器上放置核桃液加熱，酶添加量5 000 U/g，酶解過(guò)程中控制溫度55 ℃、時(shí)間45 min、料液比1∶10 g/mL，研究pH 8.0，9.0，10.0，11.0和12.0時(shí)核桃蛋白提取率，同時(shí)研究pH變化對(duì)提取率的影響。

1.3.4.2 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

稱取10 g核桃粕粉，放入燒杯中，并倒入蒸餾水配制成核桃液。將核桃液放置于磁力加熱攪拌器上加熱，酶添加量5 000 U/g，酶解過(guò)程中控制pH 10.0、時(shí)間45 min、料液比1∶10 g/mL，研究酶解溫度45，50，55，60和65 ℃時(shí)核桃蛋白提取率，同時(shí)研究溫度變化對(duì)提取率的影響。

1.3.4.3 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

稱取10 g核桃粕粉，放入燒杯中，并倒入蒸餾水配制成核桃液。將核桃液放置于磁力加熱攪拌器上加熱，酶添加量5 000 U/g，酶解過(guò)程中控制pH 10.0、溫度55 ℃、料液比1∶10 g/mL，研究酶解時(shí)間25，35，45，55和65 min時(shí)核桃蛋白提取率，同時(shí)研究時(shí)間變化對(duì)提取率的影響。

1.3.4.4 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

稱取10 g核桃粕粉，放入燒杯中，并倒入蒸餾水配制成核桃液。將核桃液放置于磁力加熱攪拌器上加熱，酶添加量5 000 U/g，酶解過(guò)程中控制pH 10.0、溫度55 ℃、時(shí)間45 min，研究料液比為1∶6，1∶8，1∶10，1∶12和1∶14 g/mL時(shí)核桃蛋白提取率，研究料液比的變化對(duì)提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定pH 8，9和10，酶解溫度45，50和55 ℃，酶解時(shí)間35，45和55 min，料液比1∶8，1∶10和1∶12 g/mL，設(shè)計(jì)并開展正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)水平表如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃粕中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

通過(guò)凱氏定氮試驗(yàn)，測(cè)得核桃粕中蛋白質(zhì)含量70%。通過(guò)對(duì)核桃粕中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，并對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)中蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比[17-20]，所用核桃粕蛋白質(zhì)含量較高。

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。用酶標(biāo)儀測(cè)定其在562 nm處的吸光度，并用Origin軟件標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，由此得出的BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.897 37x+0.078 46，R2=0.996 78。

圖1 BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響如圖2所示，pH 8.0，9.0，10.0，11.0和12.0時(shí)，蛋白質(zhì)提取率分別為50.76%，53.31%，55.12%，55.72%和49.20%，通過(guò)圖2可知，pH小于11，隨著pH增大核桃蛋白提取率不斷增大，核桃蛋白提取率增長(zhǎng)幅度不斷減小。pH超過(guò)11后，蛋白質(zhì)提取率突然出現(xiàn)大幅下降，可能是由于pH增加超過(guò)蛋白酶的最適pH，破壞蛋白酶結(jié)構(gòu)，抑制堿性蛋白酶活性，降低酶解效率，使得核桃蛋白提取率降低。因?yàn)閜H 10和11時(shí)的蛋白質(zhì)提取率變化不大，選用pH 8.0，9.0和10.0這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3.2 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響如圖3所示，酶解溫度45，50，55，60和65 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率分別為53.54%，54.95%，51.55%，47.55%和45.00%，由圖3可知，溫度低于50 ℃時(shí)，核桃蛋白提取率逐漸增加，溫度50 ℃時(shí)，核桃蛋白提取率最高，溫度超過(guò)50 ℃后，隨著溫度增加其核桃蛋白提取率緩慢減小，核桃蛋白提取率下降幅度逐漸增大。這是因?yàn)闇囟瘸^(guò)蛋白酶最適溫度，隨著溫度增加其對(duì)蛋白酶的抑制作用逐漸增大。因此，選用酶解溫度45，50和55 ℃這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響如圖4所示，酶解時(shí)間分別為25，35，45，55和65 min時(shí)，蛋白質(zhì)提取率分別為43.54%，50.66%，54.23%，55.93%和56.20%，隨著酶解時(shí)間增大，核桃蛋白提取率逐漸增加，酶解時(shí)間小于45 min，核桃蛋白提取率增長(zhǎng)幅度較大，但核桃蛋白增長(zhǎng)率不斷減小。酶解時(shí)間超過(guò)45 min，核桃蛋白提取率仍舊不斷變大，但增長(zhǎng)趨勢(shì)變得緩慢。可能因?yàn)殡S著酶解時(shí)間增大，核桃蛋白底物質(zhì)量濃度逐漸降低，底物質(zhì)量濃度降低到一定程度后，蛋白酶酶解效率大幅減小。由于酶解時(shí)間55和65 min時(shí)的核桃蛋白提取率無(wú)較大變化。因此，選用酶解時(shí)間35，45和55 min這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.4 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

料液比對(duì)核桃蛋白提取率的影響如圖5所示。

料液比分別為1∶6，1∶8，1∶10，1∶12和1∶14 g/mL時(shí)，蛋白質(zhì)提取率分別為33.17%，39.50%，50.04%，53.14%和53.47%，核桃蛋白的水解度隨著料液比增大而增大，料液比1∶6 g/mL時(shí)核桃蛋白提取率最低，可能是因?yàn)榈孜镔|(zhì)量濃度太大，從而抑制蛋白酶活性，使其酶解效率變低，料液比小于1∶12 g/mL時(shí)，核桃蛋白提取率有較大變化，料液比大于1∶12 g/mL時(shí)核桃蛋白提取率增長(zhǎng)緩慢。料液比1∶12與1∶14 g/mL的蛋白質(zhì)提取率無(wú)較大變化。因此，選用料液比1∶8，1∶10和1∶12 g/mL這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

圖5 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解反應(yīng)條件試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2所示，正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3所示。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

通過(guò)比較正交試驗(yàn)極差分析可以得知，不同因素對(duì)與蛋白酶酶解核桃粕的影響程度也不同，其中對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響最大的因素為pH，次因素為料液比，之后是酶解時(shí)間，酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響最低。從K值的分布可知，最佳處理組為A2B1C3D3，即pH 9.0、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間55 min、料液比1∶12 g/mL。經(jīng)方差分析，試驗(yàn)結(jié)果可用。由于得到的最佳酶解條件不在正交試驗(yàn)中，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化的A2B1C3D3組合的酶解條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得到核桃蛋白的提取率為62.76%，高于正交試驗(yàn)時(shí)的最高的蛋白質(zhì)提取率，因此該組酶解條件為最佳酶解條件。所以堿性蛋白酶酶解核桃粕的最佳工藝條件為pH 9.0、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間55 min、料液比1∶12 g/mL。

3 結(jié)論

以核桃粕為原料，用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，研究pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比的變化對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，得到堿性蛋白酶酶解核桃粕的最佳工藝。不同影響因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響不同，影響大小順序依次為pH＞料液比＞酶解溫度＞酶解時(shí)間，其中以pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響最大，酶解時(shí)間的影響最小。通過(guò)試驗(yàn)得到堿性蛋白酶酶解核桃粕的最佳酶解條件為pH 9.0、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間55 min、料液比1∶12 g/mL。在該酶解條件下蛋白質(zhì)提取率可達(dá)62.76%。