響應(yīng)面法優(yōu)化黃刺玫果總黃酮索氏提取工藝

任婧，王曉燕，宋高林，王進(jìn)東

1.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院（太原 030000）；2.山西省藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評中心（太原 030001）

黃刺玫果是薔薇科薔薇屬落葉灌木黃刺玫（Rosa xanthinaLindl.）的干燥成熟果實，黃刺玫果廣泛分布于我國北方各省的山區(qū)和丘陵地帶[1-2]。黃刺玫果中含有大量的維生素、多酚及總黃酮類化合物，具有理氣活血、調(diào)經(jīng)健脾的作用[1]。民間也有將其做成果醬或曬制成花果茶來飲用的習(xí)慣，以提高人體免疫力。據(jù)報道黃刺玫果總黃酮化合物具有抗氧化、抗血栓、降血脂等作用[3-6]。現(xiàn)代藥理學(xué)證明，黃酮具有抑菌消炎、抗腫瘤、抗氧化、止血等作用[7-10]。當(dāng)前社會，人們普遍生活節(jié)奏加快、工作壓力日益增大，高血壓、高血脂等疾病的發(fā)病率明顯增加。因此以黃酮類化合物為基礎(chǔ)研究針對相應(yīng)疾病的預(yù)防保健品受到人們的普遍高度重視。此外，天然黃酮類化合物具有相對安全的特點，在食品加工中也廣泛用作添加劑[11]。

近年來關(guān)于黃刺玫果總黃酮的研究主要集中在黃酮類成分的檢測及應(yīng)用，研究證實黃刺玫果中黃酮成分主要為蘆丁、槲皮素及金絲桃苷等[12-13]。目前，黃刺玫果中總黃酮的提取普遍采取溶劑熱回流法提取法，但耗時大、耗能高、提取效率低。索氏提取法采用溶劑回流和虹吸原理，連續(xù)動態(tài)提取物料，既節(jié)省溶劑，提高提取效率，且有效減少人工操作等優(yōu)勢[14]。根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果可知，索氏提取黃刺玫果總黃酮相比于傳統(tǒng)的熱回流提取方法，不僅節(jié)約溶劑，且提取效率高。試驗通過索氏提取法對黃刺玫果進(jìn)行處理，通過單因素考察提取時間、溶劑比例以及溶媒用量對總黃酮得率的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳提取工藝，提高黃刺玫果中總黃酮化合物含量為接下來進(jìn)一步分離黃刺玫果總黃酮化合物提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

黃刺玫果采摘自山西省左權(quán)縣（經(jīng)山西大學(xué)張立偉教授鑒定）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，中國食品藥品鑒定研究院）；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為國產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

索氏提取器、HH-6電熱恒溫水浴鍋（北京市長豐儀器儀表公司）、LYNX-6000冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher）、BIOMATE 3s紫外可見分光光度計（Thermo Fisher）、92SM-202A電子天平（Precisa）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[15]

用蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)品，采用甲醇配制質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL，于10 mL容量瓶中，分別加入2.0，1.6，1.2，1.0，0.8，0.4和0 mL的60%乙醇溶液；再加入5%亞硝酸鈉0.5 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁0.5 mL，放置6 min；加入4%氫氧化鈉4.0 mL。加60%的乙醇定容至刻度線，搖勻，放置15 min，于510 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。

1.3.2 樣品中黃酮的提取及測定

將黃刺玫鮮果粉碎，稱取黃刺玫果10 g，加入含有1%檸檬酸的60%乙醇80 mL[16]。利用索氏提取黃酮，提取2.5 h，過濾提取液，記錄總體積數(shù)，為樣品溶液。取樣品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，按

1.3.1 中方法操作，測定樣品中黃酮得率，按式（1）所示計算黃酮得率。

式中：C為依據(jù)回歸方程計算的樣品中黃酮含量，mg/mL；1為測定樣品濾液體積，mL；V為樣品濾液總體積，mL；M為黃刺玫果質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗設(shè)計

1.4.1 提取時間對黃酮得率的影響

稱取5份10 g的黃刺玫果，加入含有1%檸檬酸的60%的乙醇溶液100 mL，料液比為1∶10（g/mL），提取時間分別為1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h，提取黃酮，考察不同時間對黃酮得率的影響。每個試驗重復(fù)3次。

1.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響

稱取5份10 g的黃刺玫果，加入含有1%檸檬酸的不同濃度的乙醇溶液100 mL，料液比為1∶10（g/mL），提取2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%，50%，60%，70%和80%，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響。每個試驗重復(fù)3次。

1.4.3 料液比對黃酮得率的影響

稱取5份10 g的黃刺玫果，分別按1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）加入含有1%檸檬酸的60%的乙醇溶液，提取時間為2.5 h，考察不同料液比對黃酮得率的影響。每個試驗重復(fù)3次。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，以黃酮得率為響應(yīng)值，確定索氏提取法提取黃刺玫果總黃酮的最佳工藝條件，如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取時間對黃酮得率的影響

提取時間對黃酮得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對黃酮得率的影響

由圖2可知，隨提取時間的延長，黃酮得率逐漸上升，在2.5 h時，黃酮得率最高，其值為5.725 mg/g，隨著時間的繼續(xù)增加，黃酮得率開始下降，當(dāng)提取時間為3.5 h時，黃酮得率下降至3.63 mg/g。提取時間過短，提取不完全，提取效率過低；提取加熱時間過長，可能會造成黃酮的氧化，使得黃酮得率降低。因此選擇提取時間為2.5 h比較合適。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響

由圖3可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%～60%時，黃酮得率逐漸上升，在60%時到達(dá)最大值，其值為5.876 mg/g，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，黃酮得率有下降的趨勢但是并未出現(xiàn)明顯差別。可能的原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)太低時，無法使得黃酮類化合物有效溶出，對著濃度的增大，溶劑極性增大，黃酮得率增加，但增大到一定濃度時，黃酮得率不再增加，從節(jié)省溶劑方面考慮，選擇60%的乙醇比較合適。

2.2.3 料液比對黃酮得率的影響

料液比對黃酮得率的影響見圖4。

一是只有堅定不移地踐行可持續(xù)發(fā)展治水思路，才能正確把握水利改革發(fā)展方向。堅持興水惠民，努力解決流域人民群眾最關(guān)切的民生水利問題；堅持人水和諧，以太湖流域水環(huán)境綜合治理為重點，大力推進(jìn)水生態(tài)文明建設(shè)；堅持水資源可持續(xù)利用，認(rèn)真貫徹落實《太湖流域管理條例》，維護(hù)河湖健康生命；堅持水利現(xiàn)代化方向，以“智慧太湖”建設(shè)為重點，以水利信息化促進(jìn)水利現(xiàn)代化。

圖4 料液比對黃酮得率的影響

由圖4可知，料液比為1∶5～1∶15（g/mL）時，黃酮得率逐漸上升，在1∶15（g/mL）時達(dá)到最大值，其值為4.957 mg/g，隨著料液比的增大，黃酮得率到達(dá)平衡，從節(jié)約溶劑的角度考慮。選擇料液比為1∶15（g/mL）比較合適。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面分析方案與試驗結(jié)果

按照表1設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，分析方案與試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案與試驗結(jié)果

2.3.2 回歸方程的建立及顯著性分析

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，采用ANOVA對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸，得到黃酮得率（Y）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）、料液比（C）之間的二次多項回歸方程：Y=6.20+0.34A-0.016B+0.20C-0.036AB+0.30AC+0.75BC-0.91A2-0.55B2-0.14C2。回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

表3為回歸方程的方差分析表，由方差分析結(jié)果可知，該回歸方程模型極顯著（p＜0.01），失擬項p=0.089 1＞0.05，無失擬因素存在。A、BC、A2、B2對黃刺玫果總黃酮得率的影響極顯著（p＜0.01），AB、B2對黃刺玫果總黃酮的得率影響顯著（p＜0.05），AB和C2對黃刺玫果總黃酮得率的影響不顯著（p＞0.05），各因素對黃酮得率的影響依次是A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞C（料液比）＞B（提取時間）。相關(guān)系數(shù)R2=0.953 6，變異系數(shù)為4.61%，表明該模型有4.61%不能由該模型解釋，該試驗數(shù)據(jù)較可靠，該模型擬合度較高，可以用于索氏提取黃刺玫果總黃酮的理論預(yù)測。

2.3.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)值與各試驗因素，及各因素交互作用構(gòu)成的等高線和響應(yīng)面見圖5～圖7，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比中任意一個因素水平在零時，其他兩個因素的交互作用對黃酮得率的影響。

圖5為料液比為1∶15（g/mL）時，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對總黃酮得率的影響。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對黃酮得率的等高線和響應(yīng)面圖

由圖5可以看出，在提取時間一定時，黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)先增大后降低；在乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時，黃酮得率隨提取時間先增大后略有下降。等高線接近圓形，且響應(yīng)面坡度小，表明提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用不明顯，這與回歸方程方差分析的結(jié)果相符合。

圖6為提取時間為2.5 h時，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對總黃酮得率的影響。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對黃酮得率的等高線和響應(yīng)面圖

由圖6可以看出，在乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時，黃酮得率隨料液比先增大后平緩；在料液比一定時，黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)先增大后降低。等高線密集，且接近橢圓形，響應(yīng)面坡度較陡峭，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的交互作用顯著。

圖7為乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，提取時間和料液比對總黃酮得率的影響。

圖7 提取時間和料液比對黃酮得率的等高線和響應(yīng)面圖

由圖7可以看出，在提取時間一定時，黃酮得率隨著料液比的增大而增大；在料液比一定時，黃酮得率隨著提取時間先增大后降低。等高線密集且響應(yīng)面坡度陡峭，說明提取時間和料液比的交互作用顯著。

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗證試驗

根據(jù)所得到的回歸模型，預(yù)測得到索氏提取黃刺玫果中總黃酮的最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為69.34%，提取時間為2.82 h，料液比為1∶20（g/mL），此時黃刺玫總黃酮理論得率為6.289 mg/g。結(jié)合實際情況最佳工藝修改為乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時間為2.8 h，料液比為1∶20（g/mL），在此條件下進(jìn)行3次試驗驗證，結(jié)果黃刺玫總黃酮平均得率（6.198± 0.048）mg/g，實際值與理論值6.289 mg/g的誤差僅為1.4%，證明該試驗?zāi)Ｐ秃侠恚瑑?yōu)化的提取工藝切實可行，適合黃刺玫總黃酮的提取。

3 結(jié)論

試驗采用索氏提取黃刺玫總黃酮，通過單因素試驗，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和料液比對黃酮得率的影響，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。通過回歸模型預(yù)測到索氏提取黃刺玫總黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時間為2.8 h，料液比為1∶20（g/mL），此時總黃酮得率（6.198±0.048）mg/g，優(yōu)化得到的工藝合理可行，為黃刺玫總黃酮的充分提取及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。